Summary

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Published: May 08, 2016
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Summary

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Abstract

Der Darm -, die die größte Anzahl von Immunzellen von jedem Organ im Körper enthalten – sind auf fremde Antigene ständig ausgesetzt sind, sowohl mikrobielle und Nahrungs. Gegeben helfen ein zunehmendes Verständnis, dass diese luminale Antigene, die Immunantwort zu gestalten und dass Bildung von Immunzellen im Darm für eine Reihe von systemischen Erkrankungen kritisch ist, hat es bei der Charakterisierung des intestinalen Immunsystems erhöht Interesse. viele veröffentlichte Protokolle sind jedoch mühsam und zeitraubend. Wir präsentieren hier ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus dem kleinen intestinalen Lamina propria, intraepitheliale Schicht und Patches Peyer, die eine schnelle, reproduzierbar ist, und erfordert keine mühsamen Percoll Gradienten. Obwohl das Protokoll auf den Dünndarm konzentriert ist es auch für die Analyse des Kolons geeignet. Darüber hinaus stellen wir einige Aspekte, die auf die spezifische wissenschaftliche ques je eine zusätzliche Optimierung benötigention. Dieser Ansatz führt zu der Isolierung einer großen Anzahl von lebenden Lymphozyten, die anschließend für die durchflusszytometrische Analyse oder alternative Mittel zur Charakterisierung verwendet werden können.

Introduction

Die Hauptaufgabe des Dünndarms wird oft als 1 , um die Verdauung und Resorption von Nährstoffen ist. Während diese Stoffwechsel – Funktion deutlich von wesentlicher Bedeutung ist, hat der Dünndarm eine ebenso bedeutende Rolle in den Host aus dem ständigen Flut von Umweltantigene innerhalb des Lumens 2 gefunden zu schützen. Der Darmtrakt trennt die Außenwelt (z. B. luminale Antigene) aus der inneren Umgebung des Wirts mit einer Epithelschicht , die nur eine einzige Zellschicht dick ist. Als solche hat die kleine-Darm Immunsystem die gewaltige Aufgabe seine Schwelle auf Reaktivität auszugleichen, so dass fremde Antigene aus der Ernährung und commensal Mikroben die Schleimhaut mit minimal, wenn überhaupt, Immunantwort zu aktivieren, während eine robuste Antwort gegen eindringende Pathogene Montage und andere "schädlich" Antigene. Übermäßige oder unangemessene Immunantworten gegen diese Antigene zu pathologischen Krankheit führen können (z. B. inflammatory Darmerkrankung, Typ – I – Diabetes, Multiple Sklerose) , und 3-6 vermieden werden muss.

Insgesamt ist der Gastrointestinaltrakt das größte Immunorgan im Körper darzustellen gedacht, mit über 70% der Antikörper-sezernierenden Zellen 7. Die Klein intestinale Immunsystem besteht aus 3 Hauptfächer – die lamina propria (LP), der intraepithelialen Schicht und Peyer-Plaques (PPs) – dass jede 2 eine besondere Gruppe von Lymphozyten enthält. Die LP – Lymphozyten (LPLs) sind in erster Linie TCRαβ + T – Zellen mit ~ 20% B – Zellen; intraepitheliale Lymphozyten (IELs) enthalten nur sehr wenige B – Zellen mit mehr TCRγδ + T – Zellen als TCRαβ + T – Zellen; und PPs, die in der kleinen Darmwand eingebettet sekundären lymphatischen Organe sind, die ~ 80% B-Zellen. Obwohl jede dieser anatomischen Regionen leicht unterschiedliche Funktionen und ontologischen Basen hat, funktionieren sie in aharmonized Art und Weise den Wirt vor pathogenen Beleidigungen zu schützen.

Darüber hinaus gibt es wachsende Anerkennung , dass die Mikrobioten eine kritische Determinante für die Entwicklung des Darm Immunsystems, mit Anerkennung der kognaten Beziehung zwischen spezifischen Mikroben erhöht und die Ontogenese von bestimmten Zelllinien 8,9. Da darüber hinaus die Bildung des intestinalen Immunsystems in anatomisch entfernten Stellen Immunreaktionen beeinflusst (z. B. Arthritis, Multiple Sklerose, Lungenentzündung), ist es klar geworden , dass die Entwicklung des intestinalen Immunsystems zu mehr Krankheitsprozesse relevant ist , als bisher 10 erkannt -12. Als solches Interesse an quantitativ die intestinale Immunsystem Beurteilung hat sich über Wirt-Pathogen-Interaktionen erweitert jetzt Host-symbiotischer Interaktionen und die Pathogenese vieler systemischen Erkrankungen sowie umfassen.

die Variabilität der derzeitigen Methoden in der gegebenenIsolierung von Darm-Lymphozyten, eine Methode, die während Ausgleich erforderlich, um die Zeit für den Ertrag, Rentabilität und Konsistenz optimiert wird zunehmend kritisch. Protokolle, die Percoll Gradienten sind zeit- und arbeitsintensiv und möglicherweise anfällig für menschliche Fehler, was zu einer variablen Ausbeute und Lebensfähigkeit 13 beinhalten. Hierin stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Lymphozyten, die aus allen drei kleinen intestinalen Immun Abteilen. Zusätzlich, da ein zunehmendes Interesse an mikroben induzierte Veränderungen in der mukosalen Immunsystems beziehen wir Schritte, die verwendet werden können, für die horizontale Übertragung von Mikroorganismen zwischen Mäusen zu ermöglichen zu beurteilen, wie diese Veränderungen quantitativ die intestinale Immunsystem beeinflussen.

Protocol

Alle Untersuchungen wurden unter strengen Überprüfung und Richtlinien durchgeführt nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Harvard Medical School, die die Veterinär Standards, die von der American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) erfüllt. 1. Horizontale Übertragung von Bakterien über Co-Gehäuse (optional) Zur Minimierung von exogenen Kontamination (insbesondere, wenn gnotobiotischer Mäusen), üben aseptischen Bedingungen während sterile Einweg-Kä…

Representative Results

Die durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellsuspensionen von kleinen intestinalen Lymphozyten sollte eine diskrete Population von Zellen ergeben , die ähnliche haben Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften als Splenozyten (1A und 1B). Die Lymphozyten können beginnen zu sterben , wenn das Gewebe nicht bei 4 ° C während der ersten Phasen der Isolation gehalten, was in der Lymphozyten – Population eine niedrigere Vorwärtsstreuung aufweisen und schwierig zu trenne…

Discussion

Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und durchflusszytometrische Charakterisierung von kleinen intestinalen Lymphozyten, einschließlich der LPLs, IELs und Lymphozyten in die PPs. Für Interessenten bei der Bewertung, wie sich Änderungen in der Mikrobiota die kleine-Darm-Immunsystem beeinflussen, wir ausführlich die einfachen Schritte in der horizontalen Übertragung von Organismen zwischen Mäusen beteiligt verschiedenen microbiotas beherbergen. Obwohl dieses Protokoll auf den Dünndarm konzentriert, ist das…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NKS is supported by NIH award K08 AI108690.

Materials

Sterile Gloves Kimberly-Clark 555092
sterile mouse cage Innovive MS2-AD contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding
metal feeder Innovive M-FEED
water bottle Innovive M-WB-300
card holder Innovive CRD-HLD-H
autoclavable rodent chow (NIH-31M) Zeigler 4131207530
RPMI medium 1640 Gibco 11875-119
dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0) Ambion AM9262
fetal bovine serum (FBS) GemBio 100-510
dispase II Invitrogen 17105-041 the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg
collagenase, type II  Invitrogen 17101-015 the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg
dissecting scissors Roboz RS-5882
feeding needle (18 G, 2" length) Roboz FN-7905
10 ml syringe BD 305482
PBS Gibco 14190-250
Disposable Scalpel (15 blade) Miltex 4-415
curved forceps Roboz RS-5211
straight forceps Roboz RS-5132
multi-purpose cups, 120 ml VWR 89009-662
stir bar VWR 58949-062
multi-position stir plate, 9-position VWR 12621-048
stainless steel conical strainer, 3 inch  RSVP
1.5 ml tube Eppendorf 0030 125.150
100 μm cell strainer Falcon 08-771-19
40 μm cell strainer Falcon 08-771-1
50 mL conical tube Falcon 352098
1 ml syringe BD 309659
96-well plate, round-bottom Corning 3799
anti-mouse CD16/32 (Fc block) Biolegend 101320
(optional) fixable viability dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-18
10% formalin, neutral buffered Thermo Scientific 5725

References

  1. Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
  4. Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
  5. Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
  6. Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
  7. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).
  8. Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
  9. Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
  10. Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
  11. Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
  12. Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
  13. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  14. Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
  15. Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
  16. Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

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Cite This Article
Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J. Vis. Exp. (111), e54114, doi:10.3791/54114 (2016).

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