אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים
Summary
There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
Abstract
המעיים – אשר מכילים את המספר הגדול ביותר של תאי מערכת החיסון של כל איבר בגוף – חשופים כל הזמן אנטיגנים זרים, הן חיידקים תזונתיים. בהתחשב שיש לנו הבנה גוברת כי אנטיגנים לומינל אלה לעזור לעצב את התגובה החיסונית וחינוך של תאים חיסוניים בתוך המעי הוא קריטי עבור מספר המחלות מערכתיות, שם כבר עלה עניין באפיון מערכת החיסון במעי. עם זאת, פרוטוקולים רבים שפורסמו הם מפרך זמן רב. אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט עבור הבידוד של לימפוציטים מתוך שכבת הרירית מיוחדת קטנה-מעיים, שכבת intraepithelial, והטלאים של Peyer כי הוא מהיר, לשחזור, ואינו דורש הדרגתי Percoll מייגע. אף על פי הפרוטוקול מתמקד במעי הדק, זה גם מתאים ניתוח של המעי הגס. יתר על כן, אנו מדגישים היבטים מסוימים שעשויות צריך אופטימיזציה נוספת תלויים בככפרו המדעי הספציפיtion. גישה זו גורמת לבידודה של מספר גדול של לימפוציטים קיימא כי לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח תזרים cytometric או אמצעים חלופיים של אפיון.
Introduction
המשימה העיקרית של המעי הדק נחשב לעתים קרובות להיות עיכול וספיגה של חומרים מזינים 1. בעוד תפקוד המטבולי זה חיוני בבירור, המעי הדק יש תפקיד משמעותי לא פחות בהגנת המארח מן המטח המתמיד של אנטיגנים סביבה נמצאים בתוך לומן 2. המעי מפרידה בין העולם החיצוני (למשל., אנטיגנים לומינל) מהסביבה הפנימית של המארח עם שכבת האפיתל כי היא שכבה תא בודד רק עבה. ככזה, המערכת החיסונית הקטנה-מעיים יש את המשימה האדירה של איזון הסף שלה עבור תגובתיות, המאפשר אנטיגנים זרים מן חיידקי דיאטת commensal להיכנס רירי עם מינימאלי, אם בכלל, תגובה חיסונית תוך גובר תגובה חזקה נגד פתוגנים הפולשים "מזיקים" אנטיגנים אחרים. תגובות חיסוניות מוגזמות או לא מתאימות לאנטיגנים אלה יכולים להוביל למחלות פתולוגיים (למשל., Inflammaמחלות מעי טור, סוכרת מסוג I, טרשת נפוצה) ויש להימנע מהם 3-6.
בסך הכל, מערכת העיכול הוא חשב לייצג את איבר החיסון הגדול ביותר בגוף, המכיל מעל 70% מכלל התאים מפרישי נוגדן 7. המערכת החיסונית קטן-מעיים מורכב מ -3 תאים עיקריים – שכבת הרירית המיוחדת (LP), השכבה intraepithelial, וטלאים של Peyer (PPS) – שכל אחד מהם מכיל קבוצה ייחודית של לימפוציטים 2. הלימפוציטים LP (LPLs) הם בעיקר תאי TCRαβ + T עם תאים ~ 20% B; לימפוציטים intraepithelial (IELs) מכילים תאי B מעט מאוד עם יותר תאי TCRγδ + T מאשר תאי TCRαβ + T; ו- PPS, שהן איברים הלימפה משני מוטבע בקיר הקטן-מעיים, מכיל ~ 80% תאי B. למרות שכל אחד האזורים האנטומיים הללו יש פונקציות נפרדות מעט ובסיסים אונטולוגית, הם מתפקדים אהאופנה armonized להגן המארח מפני עלבונות פתוגניים.
יתר על כן, יש הערכה גוברת כי החיידקים הוא קובע קריטי להתפתחות של מערכת חיסון במעי, עם הכרה גוברת של קשר מאותו המקור בין חיידקים ספציפיים ואת ontogeny של שושלות תאים מסוימות 8,9. יתר על כן, בהתחשב בכך החינוך של מערכת החיסון במעי משפיע התגובה החיסונית לאתרים מרוחקים מבחינה אנטומית (למשל., דלקת פרקים, טרשת נפוצה, דלקת ריאות), זה הפך להיות ברור כי פיתוח של מערכת החיסון במעי רלוונטי יותר תהליכי מחלה מאשר שהוכר בעבר 10 -12. ככזה, עניין בהערכת כמותית מערכת החיסון במעי האריך מעבר אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן עכשיו כולל אינטראקציות בין מאכסן commensal ואת בפתוגנזה של מחלות מערכתיות רבות גם כן.
בהתחשב בשונות של שיטות קיימות בהבידוד של לימפוציטים מעיים, שיטה כי הוא מותאם במיוחד תשואה, הכדאיות, ועקביות תוך איזון ראוי בין הזמן הנדרש הוא קריטי יותר ויותר. פרוטוקולים שכוללים הדרגתיים Percoll הם זמן העבודה אינטנסיבית יותר, אשר נוטה טעות אנושה, מוביל התשואה משתנית ואת כדאיות 13. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבידוד והאפיון של לימפוציטים מכל 3 תאי החיסון קטנים-המעיים. בנוסף, עניין גובר נתון שינויים מושרי חיידק במערכת החיסונית ברירית, נכלולי צעדים שיכולים לשמש כדי לאפשר את ההעברה האופקית של מיקרואורגניזמים בין העכברים להעריך כיצד שינויים אלה כמותית להשפיע על המערכת החיסונית של המעי.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד וזרימת אפיון cytometric של לימפוציטים קטנים-מעיים, כולל LPLs, IELs, ואת הלימפוציטים PPS. למעוניינים בהערכה כיצד שינויי החיידקים להשפיע על המערכת החיסונית הקטנה-מעיים, נפרטנו את השלבים הפשוטים המעורבים בהעברה האופקית של אורגניזמים בין עכברי מחס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Materials
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| stir bar | VWR | 58949-062 | |
| multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
