Summary

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Published: May 08, 2016
doi:

Summary

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Abstract

Os intestinos – que contêm o maior número de células imunes de qualquer órgão do corpo – são constantemente expostos a antígenos estranhos, tanto microbiana e dietética. Dado que uma maior compreensão destes antigénios luminais ajudar a dar forma a resposta imune e que a formação de células imunitárias no intestino é crítica para uma série de doenças sistémicas, tem havido um interesse crescente na caracterização do sistema imune do intestino. No entanto, muitos protocolos publicados são árduos e consumidores de tempo. Apresentamos aqui um protocolo simplificado para o isolamento de linfócitos a partir da própria lâmina do intestino delgado, a camada intraepitelial, e placas de Peyer, que é rápido, reprodutível, e não necessita de gradientes de Percoll laboriosos. Embora o protocolo centra-se no intestino delgado, é também adequado para a análise do cólon. Além disso, destacam-se alguns aspectos que podem precisar de otimização adicional, dependendo do ques científica específicação. Esta abordagem resulta no isolamento de um grande número de linfócitos viáveis ​​que podem, subsequentemente, ser utilizadas para a análise de citometria de fluxo ou meio alternativo de caracterização.

Introduction

A tarefa principal do intestino delgado é muitas vezes considerada a digestão e absorção de nutrientes 1. Enquanto essa função metabólica é claramente essencial, o intestino delgado tem um papel igualmente importante na defesa do hospedeiro, da barragem contínua de antigénios ambientais encontradas no interior do lúmen 2. O tracto intestinal separa o mundo exterior (por exemplo., Antigénios luminais) a partir do ambiente interno do hospedeiro com uma camada epitelial que é apenas uma única camada de células de espessura. Como tal, o sistema imune do intestino delgado tem a tarefa formidável de equilibrar o seu limiar de reactividade, permitindo antigénios estranhos provenientes dos micróbios dieta e comensais de introduzir a mucosa com mínima, se alguma, resposta imune, enquanto a montagem de uma resposta robusta contra patogénios invasores e outras "prejudiciais" antígenos. Respostas imunes excessiva ou inadequada para esses antígenos pode levar a doença patológica (por exemplo., Inflammadoença tory intestino, diabetes tipo I, esclerose múltipla) e deve ser evitado 06/03.

No geral, o tracto gastrointestinal é pensado para representar a maior órgão imune no corpo, contendo mais de 70% de todas as células secretoras de anticorpos 7. O sistema imunitário do intestino delgado é constituída por 3 compartimentos principais – a lâmina própria (LP), a camada intraepitelial, e placas de Peyer (PP) – que cada um contém um grupo distinto de linfócitos 2. Os linfócitos LP (LPLs) são principalmente as células TCRαβ + T com ~ células 20% de B; linfócitos intra-epiteliais (IELs) contêm células B muito poucos com mais células TCRγδ + T do que as células TCRαβ + T; e PPS, que são órgãos linfóides secundários embutidos no intestino delgado, parede contêm células ~ 80% de B. Embora cada uma destas regiões anatómicas tem funções ligeiramente distintas e bases ontológicas, elas funcionam em AHmoda armonized para proteger o hospedeiro de insultos patogénicos.

Além disso, há um crescente apreciação que a microbiota é um determinante crítico para o desenvolvimento do sistema imunitário intestinal, com o aumento do reconhecimento cognato da relação entre os micróbios e a ontogenia específicos de determinadas linhagens celulares 8,9. Além disso, dado que a formação do sistema imune intestinal afeta as respostas imunes em locais anatomicamente distantes (por ex., Artrite, esclerose múltipla, a pneumonia), tornou-se claro que o desenvolvimento do sistema imunitário do intestino é relevante para mais processos de doença do que anteriormente reconhecido 10 -12. Como tal, o interesse em avaliar quantitativamente o sistema imunológico intestinal foi muito além interações patógeno-hospedeiro para incluir agora interações hospedeiro-comensais e patogênese de muitas doenças sistêmicas bem.

Tendo em conta a variabilidade dos métodos actuais naisolamento de linfócitos intestinais, um método que é otimizado para a produção, viabilidade e consistência, equilibrando o tempo necessário é cada vez mais crítica. Os protocolos que envolvem gradientes de Percoll são tempo e trabalho intensivo e potencialmente mais propenso a erro humano, levando a um rendimento variável e viabilidade 13. Aqui, nós fornecemos um protocolo optimizado para o isolamento e caracterização de linfócitos a partir de todos os compartimentos 3 imunes no intestino delgado. Além disso, dado o interesse crescente em alterações induzidas pelo micróbio no sistema imune das mucosas, que incluem passos que podem ser utilizados para permitir a transmissão horizontal de microrganismos entre ratos para avaliar como estas alterações afectam quantitativamente o sistema imune do intestino.

Protocol

Todos os estudos foram conduzidos em análise rigorosa e orientações de acordo com a Comissão dos Assuntos Institucionais animal Cuidado e Uso (IACUC) da Harvard Medical School, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela Associação Americana de Ciência Animal Laboratory (AALAS). 1. Horizontal transmissão de bactérias via co-habitação (Opcional) Para minimizar a contaminação exógena (especialmente se estiver usando camundongos gnotobióticos), praticar uma técnica asséptica…

Representative Results

Análise citométrica de fluxo de suspensões de células únicas de linfócitos no intestino delgado deve produzir uma população discreta de células que têm características semelhantes dispersão frontal e lateral como esplenócitos (Figuras 1A e 1B). Os linfócitos podem começam a morrer, se o tecido não é mantida a 4 ° C durante as fases iniciais do isolamento, resultando na população de linfócitos com uma dispersão frontal inferior e sendo mais difíceis…

Discussion

Nós apresentamos um protocolo para o isolamento e caracterização de citometria de fluxo de linfócitos pequenos-intestinal, incluindo a LPLs, IELs e linfócitos no PPs. Para aqueles interessados ​​em avaliar como as mudanças na microbiota afetam o sistema imunológico do intestino delgado, detalhamos os passos simples envolvidos na transmissão horizontal de organismos entre os ratos que abrigam diferentes microbiotas. Embora este protocolo centra-se no intestino delgado, o procedimento é o mesmo para a anális…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NKS is supported by NIH award K08 AI108690.

Materials

Sterile Gloves Kimberly-Clark 555092
sterile mouse cage Innovive MS2-AD contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding
metal feeder Innovive M-FEED
water bottle Innovive M-WB-300
card holder Innovive CRD-HLD-H
autoclavable rodent chow (NIH-31M) Zeigler 4131207530
RPMI medium 1640 Gibco 11875-119
dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0) Ambion AM9262
fetal bovine serum (FBS) GemBio 100-510
dispase II Invitrogen 17105-041 the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg
collagenase, type II  Invitrogen 17101-015 the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg
dissecting scissors Roboz RS-5882
feeding needle (18 G, 2" length) Roboz FN-7905
10 ml syringe BD 305482
PBS Gibco 14190-250
Disposable Scalpel (15 blade) Miltex 4-415
curved forceps Roboz RS-5211
straight forceps Roboz RS-5132
multi-purpose cups, 120 ml VWR 89009-662
stir bar VWR 58949-062
multi-position stir plate, 9-position VWR 12621-048
stainless steel conical strainer, 3 inch  RSVP
1.5 ml tube Eppendorf 0030 125.150
100 μm cell strainer Falcon 08-771-19
40 μm cell strainer Falcon 08-771-1
50 mL conical tube Falcon 352098
1 ml syringe BD 309659
96-well plate, round-bottom Corning 3799
anti-mouse CD16/32 (Fc block) Biolegend 101320
(optional) fixable viability dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-18
10% formalin, neutral buffered Thermo Scientific 5725

References

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Cite This Article
Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J. Vis. Exp. (111), e54114, doi:10.3791/54114 (2016).

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