Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em> Ex Vivo</em> Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
epikardiyal hücreleri hatları bir tek katmanlı kalp, kardiyomiyosit çoğalmasını teşvik parakrin faktörler sağlanması ve gelişiminin doğrudan ve hastalık sırasında kardiyovasküler atalarıdır katkıda bulunmaktadır. bir dizi faktör epicardium-kaynaklı hücre (EPDC) harekete karışmış olsa da, bunların daha sonraki göç ve farklılaşmayı düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, EPDC motilite ve farklılaşma çalışma vitro ve ex vivo stratejileri sunuyoruz. İlk olarak, embriyonik fare kalp sonucudur kültürü birincil epikardiyal hücreleri elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bir organ kültür sisteminde etiketli EPDC, üç boyutlu taşıma değerlendirmek için detaylı bir protokol getirmektedir. Biz epicardium içinde myocardin ilgili transkripsiyon faktörlerinin genetik silme EPDC göç zayıflatan bu teknikleri kullanarak kanıtlar sunmaktadır. Bu yaklaşım EPDC aday değiştiricileri değerlendirmek için bir platform olarak hizmet vermektedirbiyoloji ve kardiyak onarım için yararlı olabilir EPDC harekete yeni düzenleyici belirlemek için genetik veya kimyasal ekranlar geliştirmek için kullanılabilir.
Introduction
epicardium mezotel hücreleri tek bir tabaka olduğunu çizgiler kalp ve etkileri kalp gelişme, olgunlaşma ve onarım. Parakrin sinyaller son derece koordineli alışverişi yoluyla, myokard ve endokard arasındaki yakın diyalog kalp büyümesi ve non-miyosit kalp soy 1 oluşumu için vazgeçilmezdir. Epikardiyal türetilmiş hücreler (EPDC) epitelyal-to-mezenkimal geçiş (EMT) 2 ile epikardiyal hücrelerinin bir alt kümesi ile ilgili ortaya, subepikardiyal alanı ve temel miyokard işgal, ve büyük ölçüde, koroner vasküler duvar hücreleri ve kalp fibroblastlannın içine ayırt, ve a daha az bir ölçüde, endotelyal hücreler ve kardiyomiyositlerde 3-9.
Epikardiyal EMT ve EPDC istilası düzenleyen mekanizmaların salgı 10-13 hücre yüzeyi reseptörlerinin ve yapışma moleküllerinin 14,15, dede de dahil olmak üzere, çeşitli moleküllerin koordine hareket bağlanmıştırapikal-bazal polarite 16,17, küçük GTPases 18,19 ve transkripsiyon lators 2,20,21 faktörleri. EPDC göç moleküler efektör birçok tanımlanmış olmasına rağmen, stratejilerin gelişimini hızlandırmak olabilir embriyoda EPDC seferberlik teşvik fizyolojik sinyallerin daha iyi anlaşılması gelişmiş kardiyak onarım için yetişkin bu süreci manipüle etmek.
EPDC seferberlik yeni regülatörleri tespit etmeyi amaçlayan çalışmalar bu hücre popülasyonunun saflaştırılması veya bireysel epikardiyal hücrelerin göçünü izleme güveniyor. Bir veya WT1, Tcf21, Tbx18 ve / veya Aldh1a2 içeren işaretçi genler, bir arada, yaygın olarak fetal epikardiyumu 1 tanımlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu markerlerin kullanımı epikardiyal hücreleri transdif getirildiğinde epikardiyal markerlerin sentezlenmesi kalp gelişimi boyunca azalıyor ve genellikle kaybedilir EPDC optimal değildir göç izlemekmezenkimal hücreler içine ferentiation.
Cre / loxP sisteminin uygulanması, soy-izleme muhabirleri ile birlikte, kalıcı kalp gelişimi sırasında epikardiyumu ve kökenini etiketleme ve yetişkin 7,22,23 iskemik yaralanma aşağıdaki yararlı olmuştur. Çeşitli epikardiyal kısıtlı Cre hatları üretildiğini ve yaygın EPDC etiket ve koşullu gen silme stratejileri 1 için kullanılır. Bu çalışmalar çeşitli epikardiyal soylarının karakterizasyonu ve EPDC motilite ve farklılaşmasının önemli aracılar belirlenmesine yol açmıştır. Ancak, biriken kanıtlar da epicardium progenitör hücrelerin 4,24,25 heterojen bir nüfusu olduğunu göstermektedir. Böylece, epikardiyal hücrelerin sadece bir alt kümesi verilen Cre sürücüsü kullanılarak hedef olacaktır.
ne olursa olsun Cre özgüllük tüm epikardiyumu etiketlemek için, laboratuvarların sayısı akıbet cul kullanmış olmasıTure sistemleri veya ex vivo organ kültürü yöntemleri sadakatle izole veya 26-28 işaretleme kalemler genetik soy ifadesi bağlı olmaksızın epikardiyal hücreleri etiketlemek için. Ex vivo olarak taşıma çalışmaları için, oluşum safhasındaki kalpler epikardiyal EMT önce ve yeşil flüoresan proteini (GFP) -expressing adenovirüs (Ad / GFP) 9,18 ile takviye edilmiş ortam içinde kültürlendi izole edilir. Bu yaklaşım verimli, tüm epikardiyumun etiketleme ziyade Cre-aracılı rekombinasyon ile hücrelerin bir alt kümesi için izin verir. Kalp kültürler sonradan EPDC 28,29 seferber uyardığı EMT bilinen indükleyicileri maruz kalmaktadır. Ex vivo ve in vivo analizler EPDC göç sürüş detaylı mekanizmaları keşfetmek için özellikle yararlı bir yaklaşım olan in vitro epikardiyal eksplant kültürler tarafından tamamlanmaktadır.
Burada, epicardi in vitro çalışmalar için, birincil epikardiyal hücrelerin izole edilmesine yönelik yöntemleri tarif ederal EMT, hem de ex vivo olarak bir organ kültür sisteminde EPDC motilite analiz eder. Biz son zamanlarda genetik EPDC 9 aktin tabanlı göç işlemek için eksen sinyal myocardin ilgili transkripsiyon faktörü (MRTF) / serum yanıt faktörü (BAV) modülasyonu ile bu yöntemin yararını ve sağlamlığı olduğunu göstermiştir. Bulgularımız EPDC taşıma düzenleyen için gerekli bir sinyal yolunu vurgulamak da, bu yöntemler kolektif EPDC göç ve farklılaşma orkestra mekanizmaları çözülmesi için uygundur. Ayrıca, eksplant ve ex vivo kültür sistemleri kalp rejenerasyon terapötik uygulamalar için EPDC harekete yeni düzenleyici ortaya koymak için fonksiyonel ekranlarında uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada akıbet birincil epikardiyal hücreyi izole etmek ve ex vivo kalp kültürlerinde EPDC göç izlemek için ayrıntılı yöntemler özetlemektedir. akıbet kültürler için, epicardium tükenmiş kalp kaldırmak için uygun zaman deneyler arasında biraz değişir. bir gecede inkübasyon sonrasında eksplant periyodik izleme epikardiyal akıbet kapsamını ölçmek için ve fibroblastlar görünmeden önce kalbini çıkarmak için tavsiye edilir. saflık sağlamak için, kalpleri olmayan epikardiyal soy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS Sağlık (NIH) National Institutes of hibe ile desteklenmiştir [hibe sayısı R01HL120919]; Amerikan Kalp Derneği [hibe sayısı 10SDG4350046]; NIH [hibe sayısı UL1 TR000042] Rochester CTSA ödülü Üniversitesi; ve Aab CVRI gelen başlangıç fonları. MAT Howard Hughes Tıp Enstitüsü Med-içine-Grad Girişimi'nden Tıp ve Diş Hekimliği Rochester Okulu Üniversitesi hibe kısmen desteklenmiştir; ve NIH [hibe sayısı GM068411] bir Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
References
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
