Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em> Ex Vivo</em> Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie

Het epicard is een enkele laag van mesotheelcellen lijnen die het hart en effecten cardiale ontwikkeling, rijping en reparatie. Via een sterk gecoördineerde uitwisseling van paracriene signalen, de intieme dialoog tussen het myocardium en epicardium onontbeerlijk cardiale groei en de vorming van niet-cardiale myocyten lineages ^1. -Epicardiale afgeleide cellen (EPDC) komen uit een subset van epicardiale cellen door een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) ^2, binnenvallen subepicardiale ruimte en onderliggende myocardium en differentiëren grotendeels in hart- mural cellen en fibroblasten, en een mindere mate, endotheelcellen en cardiomyocyten ^3-9.

De mechanismen reguleren epicardiale EMT en EPDC invasie werden toegeschreven aan de gecoördineerde actie van verschillende moleculen, waaronder uitgescheiden liganden ^10-13, celoppervlak receptoren en adhesiemoleculen ^14,15, reguLators van apicale-basale polariteit ^16,17, kleine GTPases ^18,19 en transcriptiefactoren ^2,20,21. Hoewel veel van de moleculaire effectoren van EPDC migratie zijn gedefinieerd, een beter begrip van de fysiologische signalen die EPDC mobilisatie stimuleren het embryo kan de ontwikkeling van strategieën versnellen dit proces te manipuleren in de volwassen verbeterde cardiale regeneratie.

Studies gericht op het identificeren van nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie een beroep doen op de zuivering van deze cel populatie of het opsporen van de migratie van individuele epicardiale cellen. Een of meer markergenen, waaronder WT1, Tcf21, Tbx18 en / of Aldh1a2, wordt vaak gebruikt om de foetale epicard ¹ te identificeren. Het gebruik van deze merkers te sporen migratie EPDC niet optimaal expressie van epicardiale merkers afneemt in de loop van de ontwikkeling van het hart en wordt vaak verloren als epicardiale cellen transdif ondergaanferentiatie in mesenchymale cellen.

De toepassing van de Cre / loxP-systeem, in combinatie met-lineage tracing verslaggevers, is nuttig geweest in permanent het labelen van de epicard en de nakomelingen tijdens de ontwikkeling van het hart en de volgende ischemische schade in de volwassen ^7,22,23. Verschillende-epicardiale beperkt Cre lijnen zijn gegenereerd en worden op grote schaal gebruikt om EPDC labelen en voor conditionele gen deletie strategieën ^1. Deze studies hebben geleid tot de identificatie van verschillende epicardiale lijnen en de identificatie van kritische mediatoren van EPDC motiliteit en differentiatie. Echter, de opslag bewijs suggereert ook het epicard is een heterogene populatie van voorlopercellen ^4,24,25. Derhalve zal slechts een deel van epicardiale cellen worden gericht met een bepaalde Cre driver.

Om de gehele epicard ongeacht Cre specificiteit label, hebben een aantal laboratoria uitgroei cul benuttuur systemen of ex vivo orgaan kweekmethoden trouw isoleren of het etiket epicardiale cellen zonder afhankelijk van de expressie van een genetische markers lijn ^26-28. Voor ex vivo migratie studies, zijn embryonale harten die voorafgaand aan epicardiale EMT en gekweekt in medium, aangevuld met een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen adenovirus (Ad / GFP) ^9,18. Deze benadering maakt een efficiënte labeling van de gehele epicard plaats van een subset van cellen door Cre gemedieerde recombinatie. Hart culturen worden vervolgens blootgesteld aan bekende inductoren van EMT om de mobilisatie van EPDC ^28,29 stimuleren. Ex vivo en in vivo analyses worden aangevuld door in vitro epicardiale explantatie culturen, die een bijzonder nuttige benadering voor het verkennen van gedetailleerde mechanismen achter EPDC migratie.

We beschrijven werkwijzen voor het isoleren primaire epicardiale cellen in vitro studies epicardial EMT, alsmede een orgaan kweeksysteem voor ex vivo analyses van EPDC motiliteit. We hebben onlangs aangetoond dat het nut en de robuustheid van deze methode door genetisch moduleren van de myocardin-gerelateerde transcriptiefactor (MRTF) / serum response factor (SRF) signalering as-actine gebaseerde migratie van EPDC ⁹ manipuleren. Terwijl onze bevindingen benadrukken een signaalroute die nodig zijn voor het regelen EPDC migratie, deze werkwijzen zijn geschikt voor het ontrafelen van de mechanismen die gezamenlijk orkestreren EPDC migratie en differentiatie. Bovendien zou het explantaat en ex vivo kweeksystemen in functionele screens worden uitgevoerd om nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie te identificeren voor therapeutische toepassingen in cardiale regeneratie.