Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em> Ex Vivo</em> הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
שכבה יחידה של קווי תאי epicardial בלב, מתן גורמי paracrine מעודדי התפשטות cardiomyocyte וישירות תורם אבות לב וכלי דם במהלך התפתחות ומחלות. בעוד מספר גורמים היו מעורבים בגיוס epicardium תאים שמקורם (EPDC), המנגנונים השולטים הגירה והבחנה הבאים שלהם הם הבינו היטב. כאן, אנו מציגים במבחנה לשעבר אסטרטגיות vivo ללמוד EPDC תנועתיות והבחנה. ראשית, אנו מתארים שיטה של קבלת תאי epicardial ראשוניים על ידי תרבות תולדה מלב העכבר העוברי. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על מנת להעריך הגירה תלת ממדית של EPDC מתויג מערכת התרבות איברים. אנו מספקים ראיות באמצעות טכניקות אלה כי מחיקה גנטית של גורמי תעתוק הקשורות myocardin ב epicardium פוחתת גירת EPDC. גישה זו משמשת כפלטפורמה להעריך מכפילי מועמד של EPDCביולוגיה יכולה לשמש לפיתוח מסך גנטי או כימי לזהות רגולטורי רומן של גיוס EPDC שעשויה להיות שימושי עבור תיקון לב.
Introduction
Epicardium היא שכבה אחת של תאי mesothelial המרפדת את הלב ואת השפעות לב פיתוח, התבגרות ותיקון. באמצעות חילופי מתואם מאוד של אותות paracrine, הדיאלוג האינטימי בין שריר הלב ואת epicardium הוא הכרחי לצמיחת לב ויצירת שושלות לב הלא myocyte 1. Epicardial שמקורם בתאים (EPDC) עולים מתוך תת קבוצה של תאי epicardial דרך אפיתל-to-mesenchymal מעבר (EMT) 2, לפלוש למרחב subepicardial ואת שריר לב בסיסי, ולבדל בעיקר לתאי ציור קיר כלי דם הכליליים פיברובלסטים לב, וכדי ובמידה פחותה, תאי cardiomyocytes אנדותל 3-9.
המנגנונים המסדירים EMT epicardial ופלישת EPDC יוחסו הפעולה המתואמת של מולקולות שונות, כוללים ליגנדים מופרש 10-13, קולטנים בתא שטח ואת מולקולות דבקות 14,15, regulators קוטביות פסגה-basal 16,17, GTPases הקטן 18,19, ו שעתוק גורמי 2,20,21. בעוד רבים של effectors המולקולרי של הגירה EPDC הוגדרו, הבנה טובה יותר של אותות פיזיולוגיים המעודדים גיוס EPDC בעובר עשוי להאיץ את הפיתוח של אסטרטגיות כדי לתפעל את התהליך הזה אצל המבוגר לתיקון הלב משופרת.
מחקרים שמטרתו לאתר רגולטורי רומן של גיוס EPDC להסתמך על טיהור של אוכלוסיית תא זה או התחקות נדידת תאי epicardial פרט. אחת או שילוב של גני סמן, כולל Wt1, Tcf21, Tbx18, ו / או Aldh1a2, משמש בדרך כלל כדי לזהות את epicardium העוברית 1. עם זאת, השימוש של סמנים אלה כדי לעקוב אחר נודדות EPDC אינו אופטימלי כמו ביטוי של סמנים epicardial דועכת במהלך התפתחות הלב הולך לאיבוד לעתים קרובות כאשר תאים epicardial לעבור transdifferentiation לתאי mesenchymal.
היישום של מערכת Cre / loxP, בשיתוף עם כתבי התחקות שושלת, כבר שימושי תיוג epicardium לצמיתות וצאצאיו במהלך התפתחות לב בעקבות פציעה איסכמית המבוגר 7,22,23. כמה מוגבל epicardial קווי Cre נוצרו נמצאים בשימוש נרחב לתייג EPDC ועבור 1 אסטרטגיות מחיקת גן מותנה. מחקרים אלה הובילו את האפיון של שושלות שונות epicardial, ואת ההזדהות של מתווכים קריטיים של תנועתיות והבחנת EPDC. עם זאת, הראיות המצטברות גם מרמז על epicardium אוכלוסייה הטרוגנית של ובתאים 4,24,25. לפיכך, רק קבוצת משנה של תאי epicardial יהיה ממוקד באמצעות נהג Cre נתון.
על מנת לתייג את epicardium כולו ללא קשר סגולי Cre, מספר המעבדות נצל מבוי סתום תולדהמערכות ture או לשעבר שיטות תרבות איבר vivo לבודדות בנאמנות או תווית תאי epicardial בלי תלוי הביטוי של שושלת גנטית סמני 26-28. עבור מחקרים הגירה vivo לשעבר, לבבות עובריים מבודדים לפני EMT epicardial ו בתרבית בינוני בתוספת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing אדנו (Ad / GFP) 9,18. גישה זו מאפשרת תיוג יעיל של epicardium כולו ולא משנה של תאים על ידי רקומבינציה בתיווך Cre. תרבויות לב ובהמשך נחשפות מעוררים ידוע של EMT כדי לעורר את הגיוס של EPDC 28,29. Ex vivo ו vivo ניתוחים משלימים במבחנת תרבויות explant epicardial, אשר הן גישה יעילה במיוחד עבור חקר מנגנונים מפורטים נהיגת הגירת EPDC.
כאן אנו מתארים שיטות לבודדות תאי epicardial עיקריים לבדיקות במבחנה של epicardiאל EMT, כמו גם מערכת תרבות איבר עבור vivo לשעבר מנתח של תנועתיות EPDC. אנחנו הוכיחו לאחרונה השירות וחוסנם של שיטה זו על ידי גנטית ויסות גורם שעתוק הקשורה myocardin (MRTF) / גורם בתגובה בסרום (SRF) איתות ציר לתמרן הגירה המבוססת על אקטין של EPDC 9. בעוד ממצאינו להדגיש את אחד מסלולי איתות הכרחיים להסדרת הגירת EPDC, שיטות אלה מתאימים לפרום את המנגנונים קולקטיביים לתזמר הגירה והבחנת EPDC. יתר על כן, explant לשעבר מערכות תרבות vivo יכולים להיות מיושמים מסך פונקציונלי לזהות רגולטורי רומן של גיוס EPDC ליישומים טיפוליים התחדשות לב.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטות מפורטות לבודדים תאי epicardial ראשוניים על ידי תולדה ולעקוב אחר גירת EPDC בתרבויות vivo לשעבר לב. עבור תרבויות תולדה, בזמן המתאים כדי להסיר את הלב מדולדל epicardium משתנה מעט בין הניסויים. המעקב התקופתי אחר התפתחות explants לאחר הדגירה לילה מומלץ לאמוד את היק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (NIH) [מספר מענק R01HL120919]; איגוד הלב האמריקני [מספר מענק 10SDG4350046]; אוניברסיטת הפרס רוצ'סטר CTSA מן [מספר מענק UL1 TR000042] NIH; וקרנות אתחול מתוך Aab CVRI. MAT נתמכה בחלקה על ידי מענק של אוניברסיטת רוצ'סטר בית הספר לרפואה ורפואת שיניים מהמוסד הרפואי ע"ש הווארד יוז Med-Into-גראד יוזמת; וכן פרס שירות המוסדי רות ל Kirschstein הלאומית למחקר מן [GM068411 מספר מענק] NIH.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
References
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
