Epicardico escrescenza Cultura Assay e<em> Ex Vivo</em> La valutazione della migrazione delle cellule di derivazione epicardico
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Un singolo strato di linee cellulari epicardiche cuore, fornendo fattori paracrini che stimolano la proliferazione dei cardiomiociti e contribuendo direttamente progenitori cardiovascolari durante lo sviluppo e la malattia. Mentre un certo numero di fattori sono stati implicati nella cella (EPDC) mobilitazione epicardium-derivati, i meccanismi che regolano la loro successiva migrazione e differenziamento sono poco conosciute. Qui, vi presentiamo in vitro ed ex vivo strategie per studiare EPDC la motilità e la differenziazione. In primo luogo, si descrive un metodo per ottenere cellule epicardici primarie dalla cultura escrescenza dal cuore embrionale del mouse. Presentiamo anche un protocollo dettagliato per valutare la migrazione tridimensionale marcato EPDC in un sistema di coltura di organi. Forniamo la prova utilizzando queste tecniche che delezione genetica di fattori di trascrizione myocardin legati nel epicardio attenua la migrazione EPDC. Questo approccio funge da piattaforma per valutare modificatori candidati di EPDCbiologia e potrebbe essere usato per sviluppare schermi genetici o chimici per identificare nuovi regolatori di EPDC mobilitazione che potrebbero essere utili per la riparazione cardiaca.
Introduction
L'epicardio è un singolo strato di cellule mesoteliali che riveste il cuore e impatti cardiaca sviluppo, maturazione e riparazione. Attraverso uno scambio altamente coordinato di segnali paracrini, il dialogo intimo tra il miocardio ed epicardio è indispensabile per la crescita cardiaca e la formazione di non-miociti cardiaci linee 1. Cellule epicardial-derivato (EPDC) emergono da un sottogruppo di cellule epicardici attraverso una epiteliali-to-mesenchymal transizione (EMT) 2, invadere lo spazio subepicardico e del miocardio sottostante, e differenziare ampiamente in cellule parietali vascolari coronariche e fibroblasti cardiaci, e ad un in misura minore, le cellule endoteliali e cardiomiociti 3-9.
I meccanismi che regolano EMT epicardico e EPDC invasione sono stati attribuiti all'azione coordinata di varie molecole, tra cui ligandi secrete 10-13, recettori di superficie delle cellule e molecole di adesione, 14,15 regolatori di apicale-basale polarità 16,17, piccole GTPasi 18,19, e fattori di trascrizione 2,20,21. Mentre molti degli effettori molecolari della migrazione EPDC sono stati definiti, una migliore comprensione dei segnali fisiologici che stimolano EPDC mobilizzazione nell'embrione può accelerare lo sviluppo di strategie per manipolare questo processo nell'adulto per migliorare riparazione cardiaca.
Studi volti ad identificare nuovi regolatori di EPDC mobilitazione si basano su di purificazione di questa popolazione di cellule o di tracciare la migrazione di singole cellule epicardici. Uno o una combinazione di geni marcatori, tra WT1, Tcf21, Tbx18, e / o Aldh1a2, è comunemente usato per identificare il epicardio del feto 1. Tuttavia, l'uso di questi marcatori per tracciare migrando EPDC non è ottimale come espressione di marcatori epicardici diminuisce nel corso dello sviluppo del cuore e spesso si perde quando le cellule subiscono epicardial transdifdifferenzia- in cellule mesenchimali.
L'applicazione del sistema Cre / loxP, in collaborazione con i giornalisti lineage tracing, è stato utile per etichettare in modo permanente la dell'epicardio e dei suoi discendenti durante lo sviluppo del cuore e dopo danno ischemico nell'adulto 7,22,23. Diversi epicardici-restricted linee Cre sono stati generati e sono ampiamente utilizzate per etichettare EPDC e per il gene condizionale cancellazione strategie 1. Questi studi hanno portato alla caratterizzazione dei vari lignaggi epicardici, e l'identificazione di mediatori critici di EPDC motilità e differenziazione. Tuttavia, l'evidenza suggerisce anche accumulando dell'epicardio è una popolazione eterogenea di cellule progenitrici 4,24,25. Così, solo un sottoinsieme di cellule epicardici sarà mirata utilizzando un dato conducente Cre.
Per etichettare l'intera epicardio indipendentemente Cre specificità, una serie di laboratori hanno utilizzato cul escrescenzasistemi ture o ex vivo metodi di coltura di organi per isolare fedelmente o l'etichetta cellule epicardici senza dipendere l'espressione di un lignaggio genetico marcatori 26-28. Per ex vivo studi sulla migrazione, cuori embrionali sono isolate prima di EMT epicardico e coltivate in media integrato con una proteina fluorescente verde (GFP) esprimente adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Questo approccio consente etichettatura efficiente dell'intera epicardio piuttosto che un sottogruppo di cellule mediante ricombinazione Cre-mediata. Culture cuore vengono successivamente esposte a induttori noti di EMT per stimolare la mobilitazione di EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo analisi sono integrate da colture in vitro espianto epicardici, che sono un approccio particolarmente utile per esplorare i meccanismi dettagliati di guida migrazione EPDC.
Qui, descriviamo i metodi per isolare le cellule epicardial primarie per gli studi in vitro di epicardial EMT, nonché un sistema di coltura organo per ex vivo analisi di EPDC motilità. Abbiamo recentemente dimostrato l'utilità e la robustezza di questo metodo modulando geneticamente il fattore myocardin legati trascrizione (MRTF) / fattore di risposta del siero (SRF) di segnalazione asse di manipolare la migrazione actina-based di EPDC 9. Mentre i nostri risultati evidenziano una via di segnalazione necessaria per regolare la migrazione EPDC, questi metodi sono adatti per svelare i meccanismi che orchestrano la migrazione collettivamente EPDC e la differenziazione. Inoltre, l'ex vivo sistemi di espianto e potrebbero essere implementate in schermi funzionali per identificare nuovi regolatori di EPDC mobilitazione per le applicazioni terapeutiche nella rigenerazione cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo metodi dettagliati per isolare cellule epicardico primaria escrescenza e monitorare la migrazione EPDC in ex vivo culture cuore. Per culture escrescenza, il momento opportuno per rimuovere il cuore dell'epicardio-impoverito varia leggermente tra esperimenti. Monitoraggio periodico degli espianti, dopo una notte di incubazione si raccomanda di valutare il grado di escrescenza epicardico e per estrarre il cuore prima che appaiano i fibroblasti. Per garantire la purezza, cuori devono essere rim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS è stata sostenuta da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH) [codice di autorizzazione R01HL120919]; l'American Heart Association [codice di autorizzazione 10SDG4350046]; Università di Rochester premio CTSA dal NIH [codice di autorizzazione UL1 TR000042]; e fondi di avvio del Aab CVRI. MAT è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per l'Università di Rochester Scuola di Medicina e Odontoiatria del Howard Hughes Medical Institute Med-In-Grad iniziativa; e un Istituzionale Ruth L. Kirschstein Nazionale premio di servizio di ricerca dal NIH [codice di autorizzazione GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
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