Эпикардиального вырост Культура Анализ и<em> Ex Vivo</em> Оценка эпикардиального производный миграции клеток

Эпикард представляет собой один слой мезотелиальной клеток, что линии сердца и последствия развития сердца, созревание и ремонт. Благодаря хорошо скоординированным обмена паракриновых сигналов, Интимной диалог между миокарда и эпикарда является необходимым условием для остановки роста и формирования не-миоцитов сердца родословных ^1. Эпикардиального клетки , полученные из (EPDC) выходят из подмножества эпикарда клеток через эпителиальные-к-мезенхимальных перехода (EMT) ^2, вторгнуться в субэпикардиального пространство и основной миокард и дифференцируются в основном в коронарных сосудов стенной клеток и сердечных фибробластов, а также к в меньшей степени, эндотелиальные клетки и кардиомиоциты ^3-9.

Механизмы , регулирующие эпикардиального EMT и EPDC вторжения были отнесены к скоординированным действиям различных молекул , включая секретируемых лигандов ^10-13 рецепторов клеточной поверхности и молекул адгезии ^14,15, регулиляторов апикального-базальной полярности ^16,17, малые GTPases ^18,19 и факторов транскрипции ^2,20,21. В то время как многие из молекулярных эффекторов миграции EPDC были определены, более глубокое понимание физиологических сигналов, которые стимулируют мобилизацию EPDC в зародыше может ускорить разработку стратегий для управления этим процессом в взрослых для улучшения ремонта сердца.

Исследования, направленные на выявление новых регуляторов мобилизации EPDC полагаются на очистку этой популяции клеток или проследить миграцию отдельных клеток эпикарда. Один или комбинации генов – маркеров, в том числе Wt1, Tcf21, Tbx18, и / или Aldh1a2, обычно используется для идентификации плода эпикарда ^1. Тем не менее, использование этих маркеров для отслеживания миграции EPDC не является оптимальным, как экспрессия маркеров эпикарда убывание в течение развития сердца и часто теряется, когда эпикарда клетки подвергаются transdifференциации в мезенхимальных клетках.

Применение системы Cre / LoxP, в сочетании с LINEAGE-трассировку репортеров, было полезно в постоянно мечения эпикарда и его потомков в процессе развития сердца и после ишемического повреждения во взрослом ^7,22,23. Несколько эпикардиальные с ограничением Cre линии были сформированы и широко используются для обозначения EPDC и условной делеции гена стратегий ^1. Эти исследования привели к характеристике различных эпикардиальные линий, а также выявление критических медиаторов EPDC моторики и дифференциации. Тем не менее, накапливая данные также свидетельствуют о эпикард представляет собой гетерогенную популяцию клеток – предшественников ^4,24,25. Таким образом, только часть эпикарда клеток будут направлены с использованием данного драйвера Cre.

Для того, чтобы маркировать всю эпикарда независимо от специфики Cre, ряд лабораторий использовали нарост CULTure системы или исключая виво методы органной культуры , чтобы точно изолировать или этикетку эпикардиальные клетки , не в зависимости от экспрессии генетической линии маркеров ^26-28. Для исследований бывших естественных условиях миграции, эмбриональные сердца изолированы до эпикарда EMT и культивируют в среде , дополненной с зеленым флуоресцентным белком (GFP) -expressing аденовируса (Ad / GFP) ^9,18. Такой подход позволяет эффективно маркировки всей эпикарда, а не подмножества клеток с помощью Cre-опосредованной рекомбинации. Сердце культуры впоследствии подвергается воздействию известных индукторов EMT , чтобы стимулировать мобилизацию EPDC ^28,29. Ex естественных условиях и в естественных условиях анализов дополняются в пробирке эпикардиальные эксплантов культур, которые являются особенно полезным подходом для изучения детальных механизмов вождения миграции EPDC.

Здесь мы опишем методы выделения первичных эпикардиальные клеток для исследований в пробирке epicardiаль ЕМТ, а также система органной культуры для экс виво анализ EPDC моторики. Недавно мы продемонстрировали полезность и надежность этого метода с помощью методов генной модуляции myocardin связанных фактора транскрипции (MRTF) / коэффициент отклика сыворотки (ОСР) ось сигнализации для управления актина на основе миграции EPDC ^9. В то время как наши данные подчеркивают один сигнальный путь, необходимый для регулирования миграции EPDC, эти методы пригодны для разгадке механизмов, которые в совокупности оркестрировать миграцию и дифференцировку EPDC. Кроме того, эксплантов и бывших естественных условиях системы культуры могут быть реализованы в функциональных экранов для идентификации новых регуляторов мобилизации EPDC для терапевтических применений в регенерации сердца.