bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 2. Genel Uygulamalar
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
bir biyogüvenlik düzeyi 4 (BSL-4) çevreleme laboratuvarda çalışma zamanı ve detay için büyük dikkat gerektirir. olmayan yüksek sonucu patojenler ile bir BSL-2 laboratuvarda yapılır aynı iş BSL-4 ortamda önemli ölçüde daha uzun sürer. Bu artan zaman gereksinimi nedeniyle laboratuvar kaynaklı enfeksiyonlar, olası kontaminasyon çalışma ortamı ve yüksek sonucu patojenlerin olası sürümünden yerel halktan araştırmacı korumayı amaçlayan faktörlerin çok sayıda etmektir. laboratuvar içinde, hareket zorunlu tam vücut emniyet elbise bağlı hava hortumları nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, Sınıf II biyogüvenlik kabinleri (BSC) kaldırılır her öğenin dezenfeksiyon gereklidir. Laboratuvar uzmanları BSL-4 laboratuvar uygulamaları konusunda eğitilmelidir ve performans becerileri yüksek yeterliliğini göstermek gerekir. Bu yazının amacı, uygun prosedürleri ve laboratuvar b sağlamak için teknikleri ana hatlarıyla ortaya koymaktırörnek prosedür olarak, standart bir virütik plak deneyi kullanılarak iosafety ve deneysel doğruluk. Bir Deney görsel üzerinde durulacaktır Özellikle, uygun teknikler BSL-4 ortamında güvenli çalışma. Bu teknikler şunlardır: deneyler, uygun çalışma bitmiş Sınıf II BSC temizliği, atık yönetimi ve BSL-4 laboratuvar içinde oluşturulan atıkların güvenli bertaraf ve BSL içinden inaktive numunelerin çıkarılması için bir Sınıf II BSC kurma BSL-2 laboratuara 4 laboratuvar.
Introduction
Yüksek sonucu patojenleri ele laboratuvar personelinin güvenliği (enfeksiyon propilaksisler ne tedavi seçenekleri mevcuttur) her şeyden olduğu gibi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı biyomedikal patojen ile çalışma güvenli yürütülmesi için tesis yapımı için kurallar ve en iyi uygulamaları kurmuştur biyogüvenlik perspektifinden 1 klinik laboratuvarlar. mevzuat ve düzenleme sayesinde, uygulamaları ve prosedürleri çok bu patojenlerin ile çalışmak için uyulması gereken zorunlu gereklilikler haline gelmiştir. ABD, kolayca insandan insana aktarılan patojenlerin, yüksek vaka-ölüm oranları neden ve / veya önemli bir halk sağlığı etkisi ve biyoterörizm potansiyeline sahip, Alerji ve Bulaşıcı Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü olarak kategorize edilir hastalık (NIH / NIAID) Öncelikli A Patojenler ve ya hastalık Kontrol ve Önleme (CDC) Biyoterörizm Kategori Merkezleri A Ajanlar 2. Buna ek olarak, HBu patojenler, potansiyel biyoterörizm ajanları olan kitlesel zayiat veya ekonomi, kritik altyapı, ya da kamu güveninin 3 yıkıcı etkileri potansiyeli varsa igh sonucu patojenler Tier 1 Seç Ajanlar olarak sınıflandırılır.
BSL-4 laboratuvarlar ile enstitüleri erişim dahil BSL-4 operasyonlar, daha çok BSL-2/3 operasyonlarından daha kontrol edilir. Örneğin, bunun nedeni büyük takım eğitim gereksinimleri, geniş rehberlik gereksinimleri ve ilave tıbbi biyogüvenlik önkoşul bir BSL-2 veya BSL-3 laboratuvar ile karşılaştırıldığında BSL-4 laboratuvar erişmek için önemli ölçüde daha zordur. Buna ek olarak, bir BSL-2 veya BSL-3 tesisi 4-6 karşı bir BSL-4 tesis daha fiziksel güvenlik bariyerleri genellikle vardır. BSL-4 giriş ve çıkış işlemleri bizim ilk makalede belirtildiği gibi, laboratuvar personeli BSL-4 laboratuvar 7 içine giriş için hak kazanmak için kapsamlı eğitim ve psikolojik tarama tabi. WBSL-4 laboratuvar ithin, enfeksiyon ve hatalar riski önlenir veya kurulacak prosedürler izlenerek hafifletilmiş. Araştırma asgari çoklu görev veya dikkat dağıtıcı ile, dikkatli ve bilinçli hareket etmelidir. pozitif basınç takım elbiseli eğildim güçtür ve yüz maskesi gibi mikroskopi gibi prosedürleri kısıtlayabilir. Hacimli eldiven gibi küçük öğelerle çalışılırken veya tüpleri etiketleme olarak ince motor görevleri performansını engellemektedir. BSL-4 laboratuvarlar harcanan zamanı en aza indirmek için, laboratuvar uzmanları görev (ler) tamamlanması için BSL-4 laboratuvar içine bu malzemeleri BSL-2 laboratuvarda öncesinde yapılabilir adımları belirlemek ve daha sonra taşımak için çalışma prosedürleri gözden geçirmelidir. BSL-2 laboratuarda daha fazla işlem için malzeme çıkarırken, malzeme sabit ve mühürlü bir sekonder kapta BSL-4 laboratuvar kaldırılır. kaldırılması gerekebilir örnekleri şunları içerir: enzime bağlı immunosorbe ile analiz edilecek sabit plakaları ya da enfekte olmuş malzeme tüplerint deneyi (ELISA), imüno-floresan deneyi (İFA) ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR).
BSL-2 laboratuarlarında kıyasla BSL-4 laboratuvarlar gerekli kişisel koruyucu ekipman dayattığı fazla fiziksel sınırlamalara ek olarak, hücre kültürü plakaları ve atık yüksek sonucu patojenlerin etkisizleştirilmesi için prosedürler daha az patojenik virüsler için gerekli olan daha sıkı BSL-2 laboratuvarda incelenir. En azından, bu yöntemler, CDC gereksinimi karşılamalıdır. Örneğin, kirli hücre kültür plakaları ve diğer malzemeler arasında, nötr tamponlu formalin gibi kimyasal reaktifler ile inaktive edilebilir. Tedavi hücre kültür plakaları veya tüp, bir sıvı dezenfektan ile dolu bir daldırma tankı ile laboratuvar formalin içeren ısı ile yapıştırılan torbalar içine yerleştirilmiş ve kaldırılması bulunmaktadır. Atık kovaları dezenfektan çözümleri ile dolu ve dezenfektanlar geçici deney sırasında ve DISI için oluşturulan atık almak için kullanılır sprey, Eldiven nfecting sırasıyla biyogüvenlik kabine yüzeyleri ve aletleri temizleme. listelenen konsantrasyona Kuaterner amonyum dezenfektan solüsyon tüm ABD BSL-4 laboratuvarlar (Barr J, kişisel iletişim, 2015) için altın standart olarak kabul edilir. Bir atık kovası Katı atık kirlenme potansiyelini ortadan kaldırmak için otoklava.
adına görsel akışı ve genel BSL-4 prosedürleri sınırlamaları göstermektedir, bir yaygın olarak kullanılan virüs prosedüre bir örnek olarak, standart bir virütik plak deneyi kullanılmıştır. Viral tahlil işlemi genel olarak tarif edilirken, bu protokolde laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için kullanılan biyogüvenlik prosedürleri stres. Plak tahlil tekniği 8,9 ek arka plan için önceki klasik plak tahlil görselleştirme bakınız.
Burada sunulan prosedürler CDC 1 tarafından açıklanan BMBL talimatlarına uyun. Ancak, sunulan protokollerIRF-Frederick özgü. Her BSL-4 tesis BSL-4 laboratuvar içinde deneylerin yürütülmesini etkileyen farklı standart operasyon prosedürlerini (SOP) ve çalışma yöntemleri vardır. atık akımı yönetimi ve plak deneyleri yürütülmesi için alternatif prosedürler bu laboratuarların yönetimine ve işleyişine ilişkin olarak farklılık gösterebilir. Yine de, bir BSL-4 takım laboratuvar ve BSL-4 ortam içinde Class II dolapları işi gerçekleştirmek için prosedürlerin kurulum genel bir anlayış yüksek riskli patojenlerin çalışmaları düşünürken bilim adamları kısıtlamaları ve güvenlik etkileri anlamanıza yardımcı olacaktır. BSL-4 laboratuvarda çalışmalarını çevreleyen zorluklar dışında işbirlikçileri artan farkındalık düzeltilmiş beklenti ve araştırma topluluğu tıbbi önlemler geliştirmeye daha kolay yol açabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
BSL-4 laboratuvarda çalışma önemli bir zaman ve detaylara ek dikkat gerektirir. Bu ortamda çalışmanın herhangi bir tür iyi kapsamlı, eğitimli ve vicdani bireyler gerektirir. Tahlil laboratuar çalışanları eğitilmelidir hangi birkaç önemli kavramları karıştırmak gibi standart viral plak deneyi, BSL-4 laboratuvarda yüksek sonucu patojenler ile çalışmak için ortak bir prosedürün doğru bir model sağlar.
İlk büyük konsept yüksek sonucu patojenler için birincil ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
