（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
バイオセーフティーレベル4（BSL-4）封じ込め実験室での作業は時間と細部に大きな注意を払う必要があります。非高結果の病原体を持つBSL-2実験室で行われ、同じ仕事はBSL-4の設定にかなり長い時間がかかります。この増加した時間の要件が原因で、実験室で獲得感染症、潜在的な汚染から作業環境と高結果の病原体の可能性のあるリリースから地域社会からの研究者を保護することを目的としている多数の要因にあります。実験室の内部では、移動が必須のフルボディの安全スーツに取り付けられた空気ホースのために制限されています。また、クラスII安全キャビネット（BSCの）から削除されたすべての項目の消毒が必要です。研究所の専門家は、BSL-4実験室の慣行で訓練する必要があり、それらが実行されているスキルの高い習熟度を示さなければなりません。この記事の焦点は、研究室bを確保するために適切な手順と手法の概要を説明することです手順例として、標準的なウイルスプラークアッセイを使用してiosafetyし、実験精度。具体的には、実験を行う際にBSL-4の環境で安全に作業するための適切な技術が視覚的に強調されます。これらの技術は、次のとおりです。実験では、適切な作業が終了し、クラスII BSCの清掃、廃棄物管理やBSL-4実験室の内部で発生する廃棄物の安全な廃棄、およびBSL-内部から不活性化されたサンプルを除去するためのクラスII BSCを設定しますBSL-2実験室に4研究室。
Introduction
高結果の病原体を扱う実験者の安全性が（何の感染の予防法や治療法の選択肢が存在しない）最も重要であるように、米国保健社会福祉省は、生物医学における病原体として作業の安全な実施のための施設建設のためのガイドラインとベストプラクティスを確立しましたバイオセーフティの観点1から臨床検査室。法律や規制を通じて、慣行や手順の多くは、これらの病原体との仕事のために従わなければならない必須の要件となっています。米国、簡単に人から人へと伝達される病原体では、高い致死率をもたらし、および/または主要な公衆衛生への影響やバイオテロの可能性を持っている、アレルギー感染の健康/国立研究所の国立研究所に分類されます病（NIH / NIAID）優先度A病原体およびまたは疾病管理予防センター（CDC）バイオテロカテゴリーAエージェント2。また、Hこれらの病原体は、潜在的なバイオテロ剤である質量死傷者や経済、重要なインフラストラクチャ、または公衆の信頼3に壊滅的な影響の可能性を持っている場合IGH-結果の病原体は、ティア1選択薬として分類されます。
BSL-4実験室での研究機関へのアクセスを含むBSL-4の操作は、より高度BSL-2月3日の操作よりも制御されています。例えば、原因で、実質的なスーツのトレーニング要件、豊富な指導の要件、および追加の医療バイオセーフティの前提条件にBSL-2またはBSL-3実験室と比較して、BSL-4実験室へのアクセスを得るために、実質的にはより困難です。また、BSL-2またはBSL-3施設4-6対BSL-4施設でより多くの物理的なセキュリティの障壁は、一般的にあります。 BSL-4入口と出口の手続き上の私たちの最初の記事で概説したように、研究室のスタッフは、BSL-4実験室7に入るために修飾するために広範囲の訓練、心理的スクリーニングを受けます。 WBSL-4実験室をithin、感染症やミスの危険性が確立された手順に従うことによって回避または軽減されます。研究は、最小限のマルチタスクや気晴らしで、注意深く慎重に進まなければなりません。正圧スーツに体を曲げすることは困難であり、フェースシールドは、顕微鏡などの手順を制限することができます。かさばる手袋は、このような小物を取り扱うまたはチューブを標識として微細運動タスクのパフォーマンスを低下させます。 BSL-4実験室で費やされる時間を最小限に抑えるために、研究室の専門家は、BSL-2実験室で先に行われ、その後、タスク（複数可）の完成のためのBSL-4実験室の中にこれらの物質を輸送することができる手順を識別するために、作業手順を確認してください。 BSL-2実験室でさらに処理するために物質を除去すると、材料が固定され、密封された第2の容器内のBSL-4実験室から削除されます。除去する必要があるかもしれないサンプルの例としては、酵素結合immunosorbeによって分析される感染物質の固定されたプレートまたはチューブNTアッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ（IFA）、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）。
BSL-2実験室におけるものと比較して、BSL-4実験室に必要な個人用保護具によって課される大きな物理的な制限に加えて、細胞培養プレートで高結果の病原体の不活性化と廃棄物処理のための手順は以下の病原性ウイルスのために必要とされるものよりも厳しいですBSL-2実験室で研究。最低でも、これらの方法は、CDCの要件を満たさなければなりません。例えば、汚染された細胞培養プレートおよび他の材料は、中性緩衝ホルマリンのような化学試薬を用いて不活性化することができます。処理された細胞培養プレートまたはチューブは、液体殺菌剤が充填されたダンクタンクを介してホルマリンを含有するヒートシール用袋に入れ、実験室から除去されます。廃棄バケットは消毒液を充填し、殺菌剤は、一時的に、実験中およびDISIために発生する廃棄物を受け取るために使用されるスプレー、手袋をnfectingそれぞれ、安全キャビネット表面や器具を洗浄します。記載されている濃度の第四級アンモニウム消毒液は、すべての米国BSL-4実験室（バールJ、私信、2015）のゴールドスタンダードと考えられています。廃棄物のバケツからの固体廃棄物は、汚染の可能性を排除するためにオートクレーブ処理されます。
視覚的に一般的なBSL-4手続きのワークフローと限界を実証するための努力で、我々は一般的に使用されるウイルスの手順の例として、標準的なウイルスのプラークアッセイを使用していました。ウイルスアッセイ法は、一般的に記載されているが、我々は、このプロトコルで実験室の人員の安全を確保するために使用されるバイオセーフティ手順を強調する。プラークアッセイ技術の8,9の追加の背景については、前の古典的なプラークアッセイの視覚化を参照してください。
ここで紹介する手順は、CDC 1で概説BMBL仕様に従ってください。しかし、提示されるプロトコルは、IRF-フレデリックに固有。各BSL-4施設は、BSL-4実験室内実験の実行に影響を与える別の標準作業手順書（SOP）や操作の方法があります。プラークアッセイの廃棄物の流れの管理と実行のための代替手順では、これらの研究室の管理や操作に基づいて異なる場合があります。それにもかかわらず、BSL-4の内部クラスIIキャビネットで作業を行うためのBSL-4スーツの研究室や手順の設定の一般的な理解は、環境は、高リスクの病原体の研究を検討する際の科学者が制約と安全性への影響を理解するのに役立ちます。 BSL-4実験室での作業を取り巻く困難の外の共同研究者の意識向上が調整された期待と研究コミュニティの医療対策の開発により容易に導くことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
BSL-4実験室での作業はかなりの時間と細部への追加の注意を払う必要があります。この環境での作業のいずれかのタイプがよく徹底し、訓練を受けた、と良心的な人が必要です。アッセイは、実験室での労働者が訓練を受けなければならない、いくつかの主要な概念を伴うような標準的なウイルスプラークアッセイは、BSL-4実験室で高結果の病原体を扱うための一般的な手順の正確なモデル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
