Summary

Medidas de seguridad y procedimientos de operación en una (A) de laboratorio BSL-4: 2. Prácticas generales

Published: October 03, 2016
doi:

Summary

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

Abstract

El trabajo en un laboratorio de contención de bioseguridad de nivel 4 (BSL-4) requiere tiempo y una gran atención al detalle. El mismo trabajo que se realiza en un laboratorio BSL-2 con patógenos no de graves consecuencias tardará mucho más en un entorno BSL-4. Este aumento de las necesidades de tiempo se debe a una multitud de factores que tienen por objeto proteger el investigador de las infecciones adquiridas en el laboratorio, el ambiente de trabajo de la contaminación potencial y la comunidad local de la posible liberación de los agentes patógenos de graves consecuencias. En el interior del laboratorio, el movimiento está restringido debido a las mangueras de aire conectados a los trajes de seguridad obligatorias para todo el cuerpo. Además, se requiere la desinfección de todos los elementos que se retira de los gabinetes de bioseguridad de clase II (BSC). especialistas de laboratorio deben ser entrenados en las prácticas de laboratorio BSL-4 y deben demostrar alto dominio de las habilidades que están realizando. El objetivo de este artículo es describir los procedimientos y las técnicas de laboratorio para asegurar b adecuadasiosafety y la precisión experimental usando un ensayo de placa viral estándar como un procedimiento de ejemplo. En particular, las técnicas adecuadas para trabajar con seguridad en un entorno de BSL-4 cuando se hará hincapié visualmente la realización de un experimento. Estas técnicas incluyen: la creación de un BSC de clase II para los experimentos, limpieza adecuada del BSC Clase II cuando terminó de trabajo, gestión de residuos y eliminación segura de los residuos generados en un laboratorio BSL-4, y la eliminación de las muestras inactivadas por dentro de un BSL- 4 de laboratorio para el laboratorio BSL-2.

Introduction

Dado que la seguridad del personal de laboratorio que manipulan agentes patógenos de alto riesgo (no existen profilaxis de infección ni las opciones de tratamiento) es de suma importancia, el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos ha establecido directrices para la construcción de instalaciones y las mejores prácticas para la conducción segura de trabajo con agentes patógenos en biomédica y laboratorios clínicos desde una perspectiva de seguridad de la biotecnología 1. A través de la legislación y la regulación, muchas de las prácticas y procedimientos se han convertido en requisitos obligatorios que deben seguirse para el trabajo con estos patógenos. En los EE.UU., los patógenos que se transmiten fácilmente de persona a persona, como resultado altas tasas de letalidad, y / o tienen el potencial de gran impacto en la salud pública y el bioterrorismo, se clasifican como Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Alergias y Infecciosas Salud enfermedad (NIH / NIAID) de prioridad a y patógenos o Centros para el control y Prevención de Enfermedades (CDC) bioterrorismo Agentes de la categoría a 2. Además, hpatógenos IGH-consecuencia se clasifican como de nivel 1 Seleccione Agentes si estos patógenos son posibles agentes de bioterrorismo, tienen potencial para víctimas en masa o efectos devastadores para la economía, la infraestructura crítica, o la confianza del público 3.

BSL-4 operaciones, incluido el acceso a los institutos con BSL-4 laboratorios, están mucho más controlados que BSL-2/3 operaciones. Por ejemplo, es mucho más difícil de obtener acceso a un laboratorio BSL-4 en comparación con un laboratorio BSL-2 o BSL-3 debido a los requisitos sustanciales de formación traje, extensos requisitos de orientación, y los requisitos previos adicionales de bioseguridad médica. Además, normalmente hay barreras de seguridad más físicos en una instalación BSL-4 en comparación con una instalación BSL-2 o BSL-3 4-6. Como se indica en nuestro primer artículo sobre los procedimientos BSL-4 de entrada y salida, el personal de laboratorio se someten a una amplia formación y evaluación psicológica para calificar para el ingreso en el laboratorio BSL-4 7. Wentro del laboratorio BSL-4, riesgo de infección y se cometen errores evitarse o mitigarse siguiendo los procedimientos establecidos. La investigación debe proceder con cuidado y deliberadamente, con la multitarea o distracciones mínimas. Inclinado sobre con trajes de presión positiva es difícil, y el protector de la cara puede restringir procedimientos tales como la microscopía. guantes voluminosos impiden la realización de tareas motoras finas, tales como el manejo de objetos pequeños o etiquetar tubos. Para minimizar el tiempo de permanencia en BSL-4 laboratorios, especialistas de laboratorio deben revisar los procedimientos de trabajo para identificar los pasos que se pueden hacer por delante en un laboratorio BSL-2 y luego el transporte de estos materiales en el laboratorio BSL-4 para la realización de la tarea (s). Cuando la eliminación de los materiales para su posterior procesamiento en BSL-2 laboratorio, los materiales son fijos y retirados de la laboratorio BSL-4 en un recipiente secundario cerrado herméticamente. Los ejemplos de muestras que pueden necesitar ser eliminado incluyen: placas o tubos de material infectado fijos que serán analizadas por immunosorbe ligado a enzimasnt ensayo (ELISA), ensayo de inmunofluorescencia (IFA) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Además de mayores limitaciones físicas impuestas por el equipo de protección personal que se requiere en BSL-4 laboratorios en comparación con los de BSL-2 laboratorios, procedimientos para la inactivación de patógenos de graves consecuencias en placas de cultivo celular y la eliminación de residuos son más estrictas que las que se necesitan para los virus menos patógenos estudiado en un laboratorio BSL-2. Como mínimo, estos métodos deben cumplir con el requisito de los CDC. Por ejemplo, placas de cultivo celular y otros materiales contaminados se pueden inactivar con reactivos químicos, tales como formalina tamponada neutral. placas o tubos de cultivo de células tratadas se van a colocar en bolsas de sellado térmico que contienen formalina y se retira del laboratorio a través de un tanque de agua lleno de un líquido desinfectante. Los cucharones para basura llenas de soluciones desinfectantes y pulverizar desinfectantes se utilizan para recibir temporalmente los residuos generados durante el experimento y para DISInfecting guantes, limpieza de superficies e instrumentos de cabina de bioseguridad, respectivamente. solución desinfectante de amonio cuaternario en la concentración de la lista se considera el estándar de oro para todos los Estados Unidos BSL-4 laboratorios Barr (J, comunicación personal, 2015). Los residuos sólidos de un cubo de residuos se trata en autoclave para eliminar la posibilidad de contaminación.

En un esfuerzo para demostrar visualmente el flujo de trabajo y limitaciones de generales BSL-4 procedimientos, se utilizó un ensayo estándar de placa viral como un ejemplo de un procedimiento viral comúnmente usado. Si bien el procedimiento de ensayo viral se describe, en general, hacemos hincapié en los procedimientos de bioseguridad utilizados para garantizar la seguridad del personal de laboratorio en este protocolo. Por favor refiérase a las visualizaciones anteriores ensayo de placas clásicas de antecedentes adicionales sobre la técnica de la placa de ensayo 8,9.

Los procedimientos presentados aquí siguen las especificaciones señaladas por los CDC BMBL 1. Sin embargo, los protocolos presentados estánespecífico para el IRF-Frederick. Cada instalación BSL-4 tiene diferentes procedimientos operativos estándar (SOP) y métodos de operación que afectan a la ejecución de experimentos en el laboratorio BSL-4. Los procedimientos alternativos para la gestión del flujo de residuos y ejecución de ensayos de placa pueden diferir en función de la gestión y funcionamiento de estos laboratorios. Sin embargo, una comprensión general de la configuración de un laboratorio y procedimientos para realizar el trabajo con cabinas Clase II dentro del entorno de BSL-4 traje de BSL-4 ayudará a los científicos a entender las limitaciones y las implicaciones de seguridad cuando se contempla estudios de patógenos de alto riesgo. El aumento de la concienciación de los colaboradores externos de las dificultades que rodean el trabajo en un laboratorio BSL-4 puede conducir a expectativas ajustadas y una mayor facilidad en el desarrollo de contramedidas médicas en la comunidad de investigación.

Protocol

1. Entrada de laboratorio Reunir todos los materiales de construcción de un laboratorio BSL-2 para el experimento (por ejemplo, células, los medios y los consumibles) antes de entrar en el laboratorio BSL-4. Completar el procedimiento de entrada BSL-4 (descrito en detalle en la referencia 7). 2. Preparación de una Clase II Gabinete de Bioseguridad en el Laboratorio BSL-4 Una vez dentro del laboratorio BSL-4, garantizar l…

Representative Results

De los procedimientos apropiados dentro del laboratorio BSL-4 son fundamentales para asegurar la terminación segura y eficaz de los ensayos. Al referirse a la lista de control interno diario completado (Figura 1), el personal de laboratorio asegurar que el equipo está en pleno funcionamiento. El posicionamiento adecuado del cuerpo en el centro de la BSC se asegura de que el experimento se lleva a cabo bajo condiciones de flujo de aire óptima (Figura 2).</stron…

Discussion

Trabajo en un laboratorio BSL-4 requiere un tiempo considerable y mayor atención a los detalles. Cualquier tipo de trabajo en este entorno requiere bien entrenado, a fondo, y los individuos de conciencia. El ensayo estándar de placa viral proporciona un modelo preciso de un procedimiento común para trabajar con patógenos de graves consecuencias en el laboratorio BSL-4, ya que el ensayo implica varios conceptos principales en las que deben ser entrenados los trabajadores de laboratorio.

E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.

Materials

Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
Ethanol Fisher BP2818500
2-ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
10-ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
25-ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
6-well plates Fisher 140675
Crystal Violet Sigma HT90132-1L
10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
Tragacanth Fisher 50-702-2000 
20-μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
200-μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
1000-μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
DMEM Lonza 12-604Q
FBS Sigma F2442-500mL
Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
2X EMEM Quality Biological 115-073-101
Pipettor Drummond 4-000-101
1000-μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
200-μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
Attest Express Medical Supplies  MMM12192
Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
Autoclave Bag Fisher 01-828E
2000-ml Beaker Fisher 02-591-10H
Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
Pipette Tray Fisher 13-361-5
37°C Incubator Fisher WU-39321-00
Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
Autoclave Tape Fisher 15-903
Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
Light Box Fisher S11552
Heat Sealer Fisher NC9793612 
Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
Biohazard Bag Fisher 01-828E

References

  1. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
  2. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
  3. Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
  4. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
  5. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
  6. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
  7. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
  8. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
  9. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

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Cite This Article
Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

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