Medidas de seguridad y procedimientos de operación en una (A) de laboratorio BSL-4: 2. Prácticas generales
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
El trabajo en un laboratorio de contención de bioseguridad de nivel 4 (BSL-4) requiere tiempo y una gran atención al detalle. El mismo trabajo que se realiza en un laboratorio BSL-2 con patógenos no de graves consecuencias tardará mucho más en un entorno BSL-4. Este aumento de las necesidades de tiempo se debe a una multitud de factores que tienen por objeto proteger el investigador de las infecciones adquiridas en el laboratorio, el ambiente de trabajo de la contaminación potencial y la comunidad local de la posible liberación de los agentes patógenos de graves consecuencias. En el interior del laboratorio, el movimiento está restringido debido a las mangueras de aire conectados a los trajes de seguridad obligatorias para todo el cuerpo. Además, se requiere la desinfección de todos los elementos que se retira de los gabinetes de bioseguridad de clase II (BSC). especialistas de laboratorio deben ser entrenados en las prácticas de laboratorio BSL-4 y deben demostrar alto dominio de las habilidades que están realizando. El objetivo de este artículo es describir los procedimientos y las técnicas de laboratorio para asegurar b adecuadasiosafety y la precisión experimental usando un ensayo de placa viral estándar como un procedimiento de ejemplo. En particular, las técnicas adecuadas para trabajar con seguridad en un entorno de BSL-4 cuando se hará hincapié visualmente la realización de un experimento. Estas técnicas incluyen: la creación de un BSC de clase II para los experimentos, limpieza adecuada del BSC Clase II cuando terminó de trabajo, gestión de residuos y eliminación segura de los residuos generados en un laboratorio BSL-4, y la eliminación de las muestras inactivadas por dentro de un BSL- 4 de laboratorio para el laboratorio BSL-2.
Introduction
Dado que la seguridad del personal de laboratorio que manipulan agentes patógenos de alto riesgo (no existen profilaxis de infección ni las opciones de tratamiento) es de suma importancia, el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos ha establecido directrices para la construcción de instalaciones y las mejores prácticas para la conducción segura de trabajo con agentes patógenos en biomédica y laboratorios clínicos desde una perspectiva de seguridad de la biotecnología 1. A través de la legislación y la regulación, muchas de las prácticas y procedimientos se han convertido en requisitos obligatorios que deben seguirse para el trabajo con estos patógenos. En los EE.UU., los patógenos que se transmiten fácilmente de persona a persona, como resultado altas tasas de letalidad, y / o tienen el potencial de gran impacto en la salud pública y el bioterrorismo, se clasifican como Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Alergias y Infecciosas Salud enfermedad (NIH / NIAID) de prioridad a y patógenos o Centros para el control y Prevención de Enfermedades (CDC) bioterrorismo Agentes de la categoría a 2. Además, hpatógenos IGH-consecuencia se clasifican como de nivel 1 Seleccione Agentes si estos patógenos son posibles agentes de bioterrorismo, tienen potencial para víctimas en masa o efectos devastadores para la economía, la infraestructura crítica, o la confianza del público 3.
BSL-4 operaciones, incluido el acceso a los institutos con BSL-4 laboratorios, están mucho más controlados que BSL-2/3 operaciones. Por ejemplo, es mucho más difícil de obtener acceso a un laboratorio BSL-4 en comparación con un laboratorio BSL-2 o BSL-3 debido a los requisitos sustanciales de formación traje, extensos requisitos de orientación, y los requisitos previos adicionales de bioseguridad médica. Además, normalmente hay barreras de seguridad más físicos en una instalación BSL-4 en comparación con una instalación BSL-2 o BSL-3 4-6. Como se indica en nuestro primer artículo sobre los procedimientos BSL-4 de entrada y salida, el personal de laboratorio se someten a una amplia formación y evaluación psicológica para calificar para el ingreso en el laboratorio BSL-4 7. Wentro del laboratorio BSL-4, riesgo de infección y se cometen errores evitarse o mitigarse siguiendo los procedimientos establecidos. La investigación debe proceder con cuidado y deliberadamente, con la multitarea o distracciones mínimas. Inclinado sobre con trajes de presión positiva es difícil, y el protector de la cara puede restringir procedimientos tales como la microscopía. guantes voluminosos impiden la realización de tareas motoras finas, tales como el manejo de objetos pequeños o etiquetar tubos. Para minimizar el tiempo de permanencia en BSL-4 laboratorios, especialistas de laboratorio deben revisar los procedimientos de trabajo para identificar los pasos que se pueden hacer por delante en un laboratorio BSL-2 y luego el transporte de estos materiales en el laboratorio BSL-4 para la realización de la tarea (s). Cuando la eliminación de los materiales para su posterior procesamiento en BSL-2 laboratorio, los materiales son fijos y retirados de la laboratorio BSL-4 en un recipiente secundario cerrado herméticamente. Los ejemplos de muestras que pueden necesitar ser eliminado incluyen: placas o tubos de material infectado fijos que serán analizadas por immunosorbe ligado a enzimasnt ensayo (ELISA), ensayo de inmunofluorescencia (IFA) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Además de mayores limitaciones físicas impuestas por el equipo de protección personal que se requiere en BSL-4 laboratorios en comparación con los de BSL-2 laboratorios, procedimientos para la inactivación de patógenos de graves consecuencias en placas de cultivo celular y la eliminación de residuos son más estrictas que las que se necesitan para los virus menos patógenos estudiado en un laboratorio BSL-2. Como mínimo, estos métodos deben cumplir con el requisito de los CDC. Por ejemplo, placas de cultivo celular y otros materiales contaminados se pueden inactivar con reactivos químicos, tales como formalina tamponada neutral. placas o tubos de cultivo de células tratadas se van a colocar en bolsas de sellado térmico que contienen formalina y se retira del laboratorio a través de un tanque de agua lleno de un líquido desinfectante. Los cucharones para basura llenas de soluciones desinfectantes y pulverizar desinfectantes se utilizan para recibir temporalmente los residuos generados durante el experimento y para DISInfecting guantes, limpieza de superficies e instrumentos de cabina de bioseguridad, respectivamente. solución desinfectante de amonio cuaternario en la concentración de la lista se considera el estándar de oro para todos los Estados Unidos BSL-4 laboratorios Barr (J, comunicación personal, 2015). Los residuos sólidos de un cubo de residuos se trata en autoclave para eliminar la posibilidad de contaminación.
En un esfuerzo para demostrar visualmente el flujo de trabajo y limitaciones de generales BSL-4 procedimientos, se utilizó un ensayo estándar de placa viral como un ejemplo de un procedimiento viral comúnmente usado. Si bien el procedimiento de ensayo viral se describe, en general, hacemos hincapié en los procedimientos de bioseguridad utilizados para garantizar la seguridad del personal de laboratorio en este protocolo. Por favor refiérase a las visualizaciones anteriores ensayo de placas clásicas de antecedentes adicionales sobre la técnica de la placa de ensayo 8,9.
Los procedimientos presentados aquí siguen las especificaciones señaladas por los CDC BMBL 1. Sin embargo, los protocolos presentados estánespecífico para el IRF-Frederick. Cada instalación BSL-4 tiene diferentes procedimientos operativos estándar (SOP) y métodos de operación que afectan a la ejecución de experimentos en el laboratorio BSL-4. Los procedimientos alternativos para la gestión del flujo de residuos y ejecución de ensayos de placa pueden diferir en función de la gestión y funcionamiento de estos laboratorios. Sin embargo, una comprensión general de la configuración de un laboratorio y procedimientos para realizar el trabajo con cabinas Clase II dentro del entorno de BSL-4 traje de BSL-4 ayudará a los científicos a entender las limitaciones y las implicaciones de seguridad cuando se contempla estudios de patógenos de alto riesgo. El aumento de la concienciación de los colaboradores externos de las dificultades que rodean el trabajo en un laboratorio BSL-4 puede conducir a expectativas ajustadas y una mayor facilidad en el desarrollo de contramedidas médicas en la comunidad de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trabajo en un laboratorio BSL-4 requiere un tiempo considerable y mayor atención a los detalles. Cualquier tipo de trabajo en este entorno requiere bien entrenado, a fondo, y los individuos de conciencia. El ensayo estándar de placa viral proporciona un modelo preciso de un procedimiento común para trabajar con patógenos de graves consecuencias en el laboratorio BSL-4, ya que el ensayo implica varios conceptos principales en las que deben ser entrenados los trabajadores de laboratorio.
E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
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