Mesures de sécurité et procédures d'exploitation dans un (A) de laboratoire BSL-4: 2. Pratiques générales
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Travailler dans un niveau de biosécurité 4 (BSL-4) laboratoire de confinement exige du temps et une grande attention aux détails. Le même travail qui est fait dans un laboratoire BSL-2 avec des agents pathogènes non-haute conséquence prendra beaucoup plus de temps dans un cadre BSL-4. Cette exigence de temps accrue est due à une multitude de facteurs qui visent à protéger le chercheur d'infections acquises au laboratoire, l'environnement de travail de la contamination potentielle et la communauté locale du possible la libération d'agents pathogènes à haut conséquence. A l'intérieur du laboratoire, le mouvement est restreint en raison de tuyaux d'air attachés aux combinaisons obligatoires de sécurité pour le corps. En outre, la désinfection de chaque élément qui est retiré des armoires de classe II de biosécurité (de GCS) est nécessaire. spécialistes de laboratoire doivent être formés dans les pratiques du laboratoire BSL-4 et doivent montrer haute compétence dans les compétences qu'ils exécutent. L'objectif de cet article est de décrire les procédures et les techniques pour assurer laboratoire b appropriéesiosafety et une précision expérimentale en utilisant un dosage de plaque virale classique comme un exemple de procédure. En particulier, les techniques appropriées pour travailler en toute sécurité dans un environnement BSL-4 lors de l'exécution d'une expérience sera soulignée visuellement. Ces techniques comprennent: la mise en place d'un BSC Classe II pour des expériences, nettoyage propre de la BSC Classe II lorsque vous avez terminé de travail, gestion des déchets et d'élimination sûre des déchets générée à l'intérieur d'un laboratoire de BSL-4, et le prélèvement d'échantillons inactivés à l'intérieur d'un BSL- 4 laboratoire au laboratoire BSL-2.
Introduction
Comme la sécurité du personnel de laboratoire manipulant des agents pathogènes à haut risque (existe pas prophylaxies d'infection, ni les options de traitement) est primordiale, le US Department of Health and Human Services a mis en place des lignes directrices pour la construction des installations et des meilleures pratiques pour la conduite en toute sécurité de travail avec les agents pathogènes dans biomédicale et les laboratoires cliniques d'une biosécurité perspective 1. Grâce à la législation et la réglementation, la plupart des pratiques et procédures sont devenues des exigences obligatoires qui doivent être suivies pour le travail avec ces agents pathogènes. Aux Etats-Unis, les agents pathogènes qui sont facilement transmis de personne à personne, conduire à des taux de létalité élevés, et / ou ont le potentiel d'impact en matière de santé publique et le bioterrorisme, sont classés comme l'Institut national de la santé / Institut national des allergies et infectieuses maladie (NIH / NIAID) priorité A pathogènes et ou Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism Catégorie A Agents 2. En outre, hpathogènes aute-conséquences sont classés comme Tier 1 Sélectionnez Agents si ces agents pathogènes sont des agents potentiels de bioterrorisme, ont un potentiel de pertes massives ou des effets dévastateurs sur l'économie, les infrastructures essentielles, ou la confiance du public 3.
BSL-4 opérations, y compris l'accès aux instituts avec BSL-4 laboratoires, sont plus fortement contrôlés que 2-BSL / 3 opérations. Par exemple, il est beaucoup plus difficile d'avoir accès à un laboratoire BSL-4 par rapport à un laboratoire BSL-2 ou BSL-3 en raison des exigences importantes de formation de costume, les exigences de mentorat étendues, et les conditions préalables à la biosécurité médicale supplémentaires. En outre, il existe généralement des barrières de sécurité plus physiques dans une installation par rapport à une installation BSL-2 ou BSL-4-6 mars BSL-4. Comme indiqué dans notre premier article sur les procédures BSL-4 entrée et de sortie, le personnel de laboratoire subissent une formation approfondie et une évaluation psychologique de se qualifier pour l' entrée dans le BSL-4 laboratoire 7. Wans le laboratoire BSL-4, le risque d'infection et les erreurs sont évitées ou atténuées en suivant les procédures établies. La recherche doit procéder soigneusement et délibérément, avec le multitâche ou distractions minimes. Penchée sur en maillot de pression positive est difficile, et l'écran facial peut limiter les procédures telles que la microscopie. des gants encombrants entravent l'exécution des tâches motrices fines, telles que la manipulation de petits objets ou l'étiquetage des tubes. Pour réduire au minimum le temps passé dans BSL-4 laboratoires, spécialistes de laboratoire devraient examiner les procédures de travail pour identifier les mesures qui peuvent être faites en avance dans un laboratoire BSL-2 et ensuite transporter ces matériaux dans le laboratoire BSL-4 pour l'achèvement de la tâche (s). Lors du retrait de matériaux pour un traitement ultérieur dans BSL-2 laboratoire, les matériaux sont fixés et retirés du laboratoire BSL-4 dans un récipient secondaire étanche. Des exemples d'échantillons qui pourraient devoir être supprimés incluent: des plaques ou des tubes de matériel infecté fixes qui seront analysés par immunosorbe lié à une enzymetest nt (ELISA), immunofluorescence (IFA), ou réaction en chaîne par polymérase (PCR).
Outre l'élargissement des limitations physiques imposées par l'équipement de protection individuelle requis dans BSL-4 laboratoires par rapport à ceux de BSL-2 laboratoires, les procédures d'inactivation des agents pathogènes à haut conséquence dans des plaques de culture cellulaire et l'élimination des déchets sont plus strictes que celles qui sont nécessaires pour les virus moins pathogènes étudié dans un laboratoire BSL-2. Au minimum, ces méthodes doivent répondre à l'exigence CDC. Par exemple, la contamination des plaques de culture cellulaire et d'autres matières peuvent être inactivées par des réactifs chimiques, tels que la formaline neutre tamponnée. des plaques ou des tubes de culture de cellules traitées doivent être placés dans des sachets thermosoudables contenant du formol et retiré du laboratoire par l'intermédiaire d'une cuve d'immersion rempli d'un liquide désinfectant. seaux à déchets remplis de solutions désinfectantes et pulvérisation désinfectants sont utilisés pour recevoir temporairement les déchets générés lors de l'expérience et pour Disinfecting gants, le nettoyage des surfaces et des instruments de biosécurité cabinet, respectivement. solution d'ammonium quaternaire désinfectant à la concentration indiquée est considéré comme l'étalon-or pour tous les Etats-Unis BSL-4 laboratoires (Barr J, communication personnelle, 2015). Les déchets solides à partir d'un seau à déchets est autoclavée pour éliminer toute possibilité de contamination.
Dans un effort pour démontrer visuellement le flux de travail et les limites des généraux BSL-4 procédures, nous avons utilisé un essai de plaque virale norme comme un exemple d'une procédure virale couramment utilisée. Alors que la procédure d'analyse virale est décrite en général, nous insistons sur les procédures de biosécurité utilisées pour assurer la sécurité du personnel de laboratoire dans ce protocole. S'il vous plaît se référer à classiques précédentes visualisations de dosage de la plaque pour le fond supplémentaire sur la technique dosage de plaque 8,9.
Les procédures présentées ici suivent les spécifications définies par BMBL CDC 1. Cependant, les protocoles sont présentésspécifique à l'IRF-Frédéric. Chaque BSL-4 installation a différentes procédures d'utilisation normalisées (SOP) et les méthodes de fonctionnement qui influent sur l'exécution d'expériences au sein du laboratoire BSL-4. D'autres procédures pour la gestion des flux de déchets et l'exécution des essais de plaque peuvent varier en fonction de la gestion et l'exploitation de ces laboratoires. Néanmoins, une compréhension générale de la mise en place d'un laboratoire et des procédures pour effectuer des travaux de classe II armoires à l'intérieur de l'environnement BSL-4 BSL-4 costume aidera les scientifiques à comprendre les contraintes et les implications de sécurité au moment d'envisager des études d'agents pathogènes à haut risque. Sensibilisation accrue des collaborateurs extérieurs des difficultés de travail dans un laboratoire BSL-4 entourant peut conduire à des attentes ajustées et une plus grande facilité dans le développement de contre-mesures médicales dans le milieu de la recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Travailler dans un laboratoire BSL-4 nécessite beaucoup de temps et une plus grande attention aux détails. Tout type de travail dans cet environnement nécessite bien formé, approfondie, et les personnes de conscience. Le dosage de plaque virale standard fournit un modèle précis d'une procédure commune pour travailler avec des agents pathogènes à haut conséquence dans le laboratoire BSL-4, que le test implique plusieurs concepts majeurs dans lesquels les travailleurs de laboratoire doivent être formés. </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
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