Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) laboratorio BSL-4: 2. Pratiche generali
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Lavoro in un laboratorio di contenimento livello di biosicurezza 4 (BSL-4) richiede tempo e grande attenzione ai dettagli. Lo stesso lavoro che viene fatto in un laboratorio BSL-2 con gli agenti patogeni non ad alta conseguenza ci vorrà molto più tempo in un ambiente BSL-4. Questo aumento di requisito di tempo è dovuto ad una moltitudine di fattori che mirano a proteggere il ricercatore dalle infezioni acquisite in laboratorio, l'ambiente di lavoro dalla contaminazione potenziale e la comunità locale dal possibile rilascio di agenti patogeni ad alto conseguenza. All'interno del laboratorio, il movimento è limitato a causa di tubi dell'aria fissati ai obbligatorie tute di sicurezza di tutto il corpo. Inoltre, è necessaria la disinfezione di ogni elemento che viene rimosso dagli armadi classe II biosicurezza (BSC). specialisti del laboratorio devono essere addestrati nelle pratiche del laboratorio BSL-4 e devono dimostrare di alta competenza nelle abilità che stanno svolgendo. Il focus di questo articolo è quello di delineare le procedure e le tecniche per garantire laboratorio b adeguatiiosafety e precisione sperimentale utilizzando un saggio di placca virale standard, come un esempio di procedimento. In particolare, tecniche adeguate per lavorare in sicurezza in un ambiente BSL-4 durante l'esecuzione di un esperimento verrà sottolineata visivamente. Queste tecniche comprendono: la creazione di un BSC Classe II per gli esperimenti, la corretta pulizia del BSC Classe II, quando finito di lavorare, di gestione dei rifiuti e lo smaltimento sicuro dei rifiuti prodotti all'interno di un laboratorio BSL-4, e la rimozione di campioni inattivati dall'interno di un BSL- 4 di laboratorio al laboratorio BSL-2.
Introduction
Poiché la sicurezza del personale di laboratorio di manipolazione di agenti patogeni ad alto conseguenza (non esistono profilassi delle infezioni, né le opzioni di trattamento) è di primaria importanza, il Dipartimento di Salute e Servizi Umani ha stabilito le linee guida per la costruzione impianto e le migliori pratiche per lo svolgimento sicuro del lavoro con agenti patogeni Biomediche e laboratori clinici dal punto di vista sicurezza biologica 1. Attraverso la legislazione e la regolamentazione, molte delle pratiche e delle procedure sono diventate requisiti obbligatori che devono essere seguite per il lavoro con questi patogeni. Negli Stati Uniti, gli agenti patogeni che possono essere facilmente trasmessi da persona a persona, portare a elevati tassi di letalità, e / o che hanno il potenziale per la maggior impatto sulla salute pubblica e bioterrorismo, sono classificati come National Institute of Health / National Institute of Allergy e infettive malattia (NIH / NIAID) Priorità a Agenti patogeni e o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism categoria a Agents 2. Inoltre, hpatogeni IGH-conseguenza sono classificati come Tier 1 selezionare gli agenti se questi agenti patogeni sono potenziali agenti di bioterrorismo, hanno un potenziale per incidenti di massa o effetti devastanti per l'economia, le infrastrutture critiche, o la fiducia del pubblico 3.
BSL-4 operazioni, compreso l'accesso agli istituti con BSL-4 laboratori, sono più altamente controllati di BSL-2/3 operazioni. Ad esempio, è sostanzialmente più difficile ottenere l'accesso a un laboratorio BSL-4 rispetto ad un laboratorio BSL-2 o BSL-3 a causa dei requisiti sostanziali di formazione tuta, ampi requisiti di mentorship, e ulteriori requisiti di biosicurezza medico. In aggiunta, ci sono tipicamente barriere di sicurezza più fisico in una struttura BSL-4 contro un BSL-2 o BSL-3 struttura 4-6. Come indicato nel nostro primo articolo sulle procedure di BSL-4 entrata e di uscita, il personale di laboratorio sottoposti a una formazione completa e screening psicologico a qualificarsi per l'ingresso nella BSL-4 di laboratorio 7. Wntro il laboratorio BSL-4, il rischio di infezione e gli errori sono evitati o mitigati seguendo procedure stabilite. La ricerca deve procedere con cautela e deliberatamente, con multitasking minimo o distrazioni. Chinandosi in giacca e cravatta a pressione positiva è difficile, e la visiera può limitare le procedure, come la microscopia. guanti ingombranti ostacolano lo svolgimento delle funzioni motorie, come ad esempio la manipolazione di piccoli oggetti o l'etichettatura tubi. Per ridurre al minimo il tempo trascorso in BSL-4 laboratori, specialisti del laboratorio dovrebbero rivedere le procedure di lavoro per identificare i passi che può essere fatto in anticipo in un laboratorio BSL-2 e quindi il trasporto di questi materiali nel laboratorio BSL-4 per il completamento del compito (s). Durante la rimozione di materiali per l'ulteriore elaborazione in BSL-2 di laboratorio, i materiali sono fissi e rimossi dal laboratorio BSL-4 in un contenitore secondario sigillato. Esempi di campioni che possono avere bisogno di essere rimosso includono: lastre o tubi di materiale infetto fisse che verranno analizzati da immunosorbe enzyme-linkedsaggio nt (ELISA), test di immunofluorescenza (IFA), o la reazione a catena della polimerasi (PCR).
Oltre ad essere più limiti fisici imposti dal dispositivo di protezione individuale richiesto nella BSL-4 laboratori a confronto con quelli BSL-2 laboratori, le procedure per l'inattivazione degli agenti patogeni ad alto conseguenza in piastre di coltura cellulare e lo smaltimento dei rifiuti sono più rigorosi di quelli necessari per i virus meno patogeni studiata in un laboratorio BSL-2. Come minimo, questi metodi dovrebbero soddisfare le richieste del CDC. Per esempio, piastre di coltura cellulare contaminati e altri materiali possono essere inattivati con reagenti chimici, quali formalina neutra tamponata. piastre di coltura cellulare o tubi trattati saranno collocate in buste termosaldante contenenti formalina e rimosso dal laboratorio con un serbatoio dunk riempito con un liquido disinfettante. secchi rifiuti pieni di soluzioni disinfettanti e spray disinfettanti vengono utilizzati per ricevere temporaneamente i rifiuti prodotti durante l'esperimento e per disinfecting guanti, la pulizia di superfici e strumenti armadio biosicurezza, rispettivamente. Quaternario di ammonio in soluzione disinfettante alla concentrazione indicata è considerata il gold standard per tutti gli Stati Uniti BSL-4 laboratori (Barr J, comunicazione personale, 2015). Rifiuti solidi da un secchio di rifiuti è in autoclave per eliminare rischio di contaminazione.
Nel tentativo di dimostrare visivamente il flusso di lavoro e limitazioni di procedure generali BSL-4, abbiamo usato un saggio di placca virale standard come esempio di una procedura virale comunemente usato. Mentre la procedura del test virale è descritta in generale, sottolineiamo le procedure di biosicurezza utilizzate per garantire la sicurezza del personale di laboratorio in questo protocollo. Si prega di fare riferimento alle precedenti visualizzazioni saggio di placca classici per il fondo supplementare sul saggio di placca tecnica di 8,9.
Le procedure qui presentati seguono le specifiche BMBL delineate dal CDC 1. Tuttavia, i protocolli sono presentatispecifica al IRF-Frederick. Ogni struttura BSL-4 ha diverse procedure operative standard (SOP) e dei metodi operativi che influenzano l'esecuzione di esperimenti all'interno del laboratorio BSL-4. Procedure alternative per la gestione dei rifiuti e l'esecuzione di test di placca può variare in base sulla gestione e il funzionamento di questi laboratori. Tuttavia, una comprensione generale del setup di un BSL-4 di laboratorio e le procedure per l'esecuzione di lavori di classe II armadi all'interno dell'ambiente BSL-4 tuta aiuterà gli scienziati a capire i vincoli e le implicazioni di sicurezza quando contemplando studi di agenti patogeni ad alto rischio. Una maggiore consapevolezza di collaboratori esterni delle difficoltà che lavoro in un laboratorio BSL-4 circostanti può portare ad aspettative regolato e maggiore facilità nello sviluppo di contromisure mediche nella comunità di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lavoro in un laboratorio BSL-4 richiede molto tempo e ulteriore attenzione ai dettagli. Qualsiasi tipo di lavoro in questo ambiente richiede ben addestrato, approfondita, e gli individui coscienziosi. Il saggio di placca virale standard fornisce un modello accurato di una procedura comune per lavorare con gli agenti patogeni ad alto conseguenza in laboratorio BSL-4, come il saggio coinvolge alcuni importanti concetti in cui devono essere addestrati personale di laboratorio.
Il primo concetto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
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