Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der Furman University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (: A3242-01 Permit-Nummer) genehmigt. Alle Materialien und Geräte in diesem Protokoll verwendet werden, können in der Tabelle der Materialien und Geräte gefunden werden, während Puffer verwendet werden, können in der Tabelle der Puffer und Lösungen gefunden werden. 1. Einzelzellsuspension von Lymphozyten aus Maus-Milz Opfern Mäusen über CO 2 Ersticken. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Genickbruch. Hinweis: Verwenden Sie Milz von zwei 6-8 Wochen alten Mäusen isogenen (zB C57B / 6) des gleichen Geschlechts. Typischerweise werden zwei Milzen verarbeitet. Sprühen Sie die Tiere ausgiebig mit 70% Ethanol-Lösung und zu orientieren, so dass der Kopf nach links. Mit einer Pinzette, heben Sie die Haut des Tieres nach oben und weg von ter Körper. Mit einer Schere, schneiden Sie eine kleine Kerbe durch die Haut in der Nähe des Bauches des Tieres. Mit den Fingern, ziehen Sie jede Seite der Kerbe auf das Bauchfell vom Nacken bis zum Anfang der Hinterbeine aus. Die Milz sollte sichtbar direkt unter dem Bauchfell sein. Mit einer Pinzette, heben Sie das Bauchfell und machen einen kleinen Einschnitt, um die Milz aus. Entfernen Sie die Milz mit einer Pinzette und mit einer Schere zu necken Nicht aufge Fett- und Bindegewebe. Platzieren der Milz in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml PBS mit 2% fötalem Rinderserum (nachstehend als PBS + 2% bezeichnet). Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis bereit, die Einzelzellsuspension zu beginnen. Anmerkung: Typische Erholung zwischen 60-90 Millionen Zellen pro Milz und in der Regel werden 2 Millionen Zellen pro Probe benötigt wird. Führen Sie alle folgenden Schritte in einer Gewebekultur Kapuze. Dekantiert man die Milz in eine sterile 100 mm Gewebekulturschale. Erhalten zwei mattierten Objektträger und halten ter gleitet, so daß die beiden Grob mattierte Oberflächen nach innen in Richtung zueinander. Befeuchten Sie die Folien in der PBS + 2% Lösung gegossen in die Petrischale. Halten Sie die Milz zwischen den mattierten Oberflächen der Objektträger, mit den Kanten immer noch unter Wasser, und schleifen die Milz sanft, indem die Objektträger hin und her gegeneinander (Abbildung 1A). Die Zellen werden in die Petrischale fallen. Weiter Schleifen, bis alle Zellen wurden veröffentlicht und die Überreste der Milz weiß erscheinen (Abbildung 1B). Erstellen Sie die Zellsuspension in einer Pipette und filtern sie langsam durch einen 70 um Filter in ein neues steriles 50 ml konischen Röhrchen. Man beachte, daß kleine Stücke von rotem Fruchtfleisch wird auf dem Filter (2A) vorliegen. Wenn der Filter steigt sanft heben ihn leicht die Flüssigkeit durch abtropfen und legen Sie den Filter wieder in das 50 ml konischen Rohr und auch weiterhin zu ermöglichen, diesen Vorgang wiederholen wie nötig. Wenn Verarbeitung von mehr als 5 SPLeens, kann es notwendig sein, in zwei Reihen unterteilen und mit einem neuen Filter für jeden. Unter Verwendung der Anschlagabschnitt eines 3-ml-Spritze und drücken Sie vorsichtig das rote Fruchtfleisch mit den restlichen Zellen durch das Sieb (2B). Achten Sie darauf, sowohl die Filter unten und seitlich zu drücken, um sicherzustellen, dass alle roten Pulpa durch den Filter (Abbildung 2c) übergeben. In 10 mlof PBS + 2% in die Gewebekulturschale und nutzen diese, um das Rutschen, Spritzenstopper und Teller waschen, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen. Übergeben Sie diese über den gleichen 70 um Zellsieb in die 50 ml konischen Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf. Zentrifugieren Sie die gefilterten Zellsuspension bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen, darauf achten, nicht um das Pellet zu stören. Eine Spurenmenge von PBS + 2% in der Röhre verbleiben. Das Röhrchen und Flick das Pellet, bis das Pellet vollständig resuspendiert. Lyse roter Blutkörperchen des Anbietersding 2 ml ACK-Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2, bei 4 ° C) pro Milz mit dem konischen Rohr und drehen, und das Röhrchen, um sicherzustellen, dass alle Zellen in Kontakt mit der ACK-Puffer. Vorsichtig schwenken die Tube für 1 min bei RT. Bringe das Volumen der Zellsuspension auf 50 ml durch Zugabe von PBS + 2% das Rohr, um das ACK-Puffer neutralisiert. Das Röhrchen 10 Mal und Zentrifuge für 5 Minuten bei 300 · g bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, sollte das Pellet weiß (Abbildung 3). Vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen, darauf achten, nicht um das Pellet zu stören. Lassen Sie eine Spurenmenge von PBS + 2% im Rohr, die Kappe der Röhre, und Flick des Pellets, um es wieder zu suspendieren. 10 ml der T-Zell-Medium [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, 1 mM Natriumpyruvat, 1 × nicht-essentiellen Aminosäuren, 1x Penicillin / Streptomycin und 50 mM β-Mercaptoethanol] und ferner das Pellet durch vorsichtigesAuf- und Abpipettieren. Dann filtern die Suspension durch eine neue 70-um-Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Verwenden Sie ein anderes 5-10 ml des T-Zell-Medien, um die ursprüngliche Rohr spülen und leiten Sie diese durch die 70 & mgr; m-Filter in das Rohr den Rest der gefilterten Zellen enthält. Wenn die Verarbeitung mehr als zwei Milzen, kann das Volumen der T-Zell-Medium erhöht, um Erholung zu maximieren. Halten Sie Zellen auf Eis, bis bereit, gefärbt werden. Zellen sollten gezählt und die Lebensfähigkeit abgerufen. Um Zellen zu zählen, zu kombinieren 3 ml von Zellen mit 24 ml PBS + 2% und 3 ml 0,4% Trypanblau. Legen Sie 10 ml dieser in jede Kammer eines verbesserten Neubauer Zählkammer. Lebensfähigkeit, wie durch Trypanblau-Ausschluss bewertet, liegt typischerweise zwischen 85-95%. 2. Die Lebensfähigkeit und Oberflächenfärbung Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 300 × g bei 4 ° C. Die Zellen in T-Zell-Medium auf eine Konzentration von 1 x 10 7 Zellen / ml. Transfer 2 Millionen Zellen (100 ml) in eine Vertiefung einer U-Boden-96-Well-Gewebekulturplatte. Zentrifugieren Sie die Platte mit 96 Vertiefungen für 10 Minuten bei 300 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung durch Schwenken Flüssigkeit im Well-Platte in die Spüle (das Zellpellet wird in der gut bleiben) und tupfte die Platte auf einem sauberen Papiertuch. Die Zellen werden durch Resuspendieren in 200 & mgr; l PBS, gefolgt von Zentrifugation bei 300 · g für 10 min bei 4 ° C. Führen Sie alle Waschanlagen auf diese Weise wenn nicht anders angegeben. Hinweis: Verwenden Sie keine PBS + 2%, wie es mit der fixierbaren PI-Färbung stören. Entfernen Sie den Überstand durch Schwenken der Platte und mit 100 ml frisch zubereitet kommerziellen Flecken (zB fixierbar rote tote Zelle Färbung) in jede Vertiefung. Machen Sie den Fleck durch Verdünnen der Reaktivfarbstoff Stammlösung 1:10 in DMSO, gefolgt von einer Verdünnung von 1:10 in PBS. Die Platte bei 4 ° C für 30 min lichtgeschützt. Zentrifugieren Sie die pEnde für 10 Minuten bei 300 × g bei 4 ° C. An diesem Punkt vorwärts, führen alle Arbeiten mit der Platte mit der Gewebekultur Haube Licht aus. Entfernen Sie den Überstand durch Ausklopfen der Platte und dann mit 100 ml Fc-Block-Lösung. Machen Fc-Block-Lösung, die durch Verdünnen Fc-Block-Stammlösung 1: 100 in PBS. Verdünnter Antikörper für Oberflächenfärbung in PBS verwendet werden (beispielsweise anti-CD4- oder anti-CD8) und 100 ml in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte mit 96 Vertiefungen für 30 Minuten bei 4 ° C vor Licht geschützt. Hinweis: Oberflächenflecken Antikörper sollten für eine optimale Leistung titriert werden. Typischerweise eine 1: 200 oder 1: 400 Verdünnung, nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. 3. intrazelluläre Färbung für Histone H3 Nach der Inkubation der Oberfläche Flecken, waschen Sie die Zellen zweimal in PBS. Nach dem letzten Waschen werden 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte mit 96 Vertiefungen 5 min bei RT. Machen Sie 4% Paraformaldehyd durch verding 16% Paraformaldehyd in PBS. Machen Sie dieses frisch. In PBS waschen Sie die Zellen zweimal. Machen Perm / Blocks-Lösung (stock Perm Lösung PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, bei 4 ° C) durch die Kombination von 2 ml normales Kaninchenserum pro 100 ml stock Perm-Lösung. Machen Sie genug für 60 ml / Probe. In 40 ml Perm / Blocks zu jeder Probe gut und gut mischen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren, kümmert sich nicht um Blasen zu machen. Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für 45 Minuten im Dunkeln. Sparen restlichen Perm / Blocks für Schritt 3.6. Verdünnen Sie fluoreszenz konjugierten Histon H3K4me1-Antikörper in Perm / Blocks Lösung in Schritt 3.5 vorbehalten, und fügen Sie 10 ul dieser Verdünnung in jede Vertiefung. Mix durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren der Platte mit 96 Vertiefungen im Dunkeln für 1 Stunde bei 4 ° C. Hinweis: Verwenden Sie ein H3K4me1 Antikörper konjugiert mit dem R-Phycoerythrin Konjugation Kit gemäß Herstellerangaben. Zweimal in PBS + 2% wasche die Zellen. Resuspendieren der Zellen in 200mgr; l PBS + 2% und übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Analyse. Die Proben können bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. Um optimale Ergebnisse zu analysieren die Proben innerhalb von zwei Tagen. Einzeln gefärbte Proben können als Durchflusszytometrie Kompensationskontrollen verwendet werden.