استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T
Summary
التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم حالة لونين داخل الخلايا T. هذا البروتوكول يسمح العلماء لتفسير الأدلة من لونين decondensation خلال تنشيط الخلايا T يدل على زيادة في كثافة يعني الإزهار (MFI) من الفلورسنت الأجسام المضادة هيستون H3
Abstract
خلال الاستجابة المناعية المناسبة، وخلايا T هادئة تصبح تفعيلها عند تقديم المستضد إلى الخلايا التائية مستقبلات المستضد محددة لهم. وهذا يؤدي إلى انتشار نسيلي فقط تلك الخلايا T التي تحمل مستقبلات تعترف المستضد. decondensation لونين هو السمة المميزة لتنشيط الخلايا T ومطلوب للخلايا T لاكتساب القدرة على التكاثر بعد الاشتباك المستضد. ويمكن الكشف عن هذا التغيير في التكثيف لونين باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتينات هيستون. هذه الأجسام المضادة لا يمكن ربط الحواتم في خلايا T ساذجة، فضلا عن أنها يمكن في تنشيط خلايا تي. نحن تصف كيفية صمة عار في وقت واحد T علامات سطح خلية محددة، وتتبع جدوى مع وصمة عار الخلايا الميتة يمكن حلها، وقياس وضع لونين عن طريق تلطيخ الخلايا من البروتينات هيستون H3. ويتم تحليل الخلايا الملون بواسطة التدفق الخلوي ويتم قياس وضع التكثيف لونين كما شدة متوسط مضان (MFI) من وصمة عار هيستون H3. Chromatفي decondensation خلال تنشيط الخلايا T ويتجلى كزيادة في مؤسسات التمويل الأصغر
Introduction
التدفق الخلوي هي التكنولوجيا القائم على الليزر المتقدمة لتحليل العوامل الفيزيائية والفلورسنت متعددة في السكان الخلية. هذه التقنية تعمل كخلايا علقت في تيار من السوائل لقاء ليزر، علامات الفلورسنت مثيرة على أو داخل الخلايا. هذه العلامات ثم ينبعث الضوء التي يتم الكشف عنها وكميا عن طريق أنابيب مضخم. في الوقت الذي جرت العادة على استخدامها التدفق الخلوي لتحديد السكان من الخلايا، وقد ثبت أن تكون التكنولوجيا مفيدة عند دراسة مجموعة من خصائص الخلايا بما في ذلك خلايا سلامة الغشاء، تفاعلات البروتين البروتين والاتجار البروتين 1-3. قمنا بتطوير بروتوكول تسمح هذه التكنولوجيا لاستخدامها للكشف عن حالة من لونين في الخلايا T كما يتم تنشيطها في المختبر 4. وقد استخدمنا أيضا هذا البروتوكول للتحقيق في آلية الناجم عن تفعيل لونين decondensation خلايا T 5.
T خلية activatioن وانتشار حاسمة للاستجابة المناعية المناسبة. خلايا T، مجموعة فرعية معينة من الخلايا الليمفاوية داخل الجهاز المناعي، وهناك حاجة لالاستجابات المناعية المناسبة وتطوير الذاكرة المناعية. يبدأ التنشيط عند تقديم المستضد في سياق معقد التوافق كبيرا على مستقبلات الخلايا T (TCR) الموجود على سطح الخلية لخلايا T هادئة (إعادة النظر في 6). هذا يتسبب في سلسلة من الأحداث الجزيئية الحيوية وأمر غاية داخل الخلايا T التي تبلغ ذروتها في زيادة CA2 بين الخلايا + تركيز 7 والنبات النووي من عوامل النسخ المطلوبة لتفعيل (إعادة النظر في 10/8). مرة واحدة تنشيط خلايا T اكتساب القدرة على الاستجابة لانترلوكين 2 (IL-2)، وهو عامل نمو قوي أن يستخدم JAK (يانوس كيناز) / STAT (اشارة محول والمنشط من النسخ) طريقا لدفع انتشار نسيلي المنشط T الخلايا 11. لفترة وجيزة، IL-2 التحفيزالنتائج في الفسفرة من البروتينات STAT، وهي عائلة من كامنة عوامل النسخ عصاري خلوي. مرة واحدة فسفرته والبروتينات STAT dimerize، نقل من إلى النواة ومحرك التعبير عن الجينات بما فيها تلك التي تشارك في تقدم دورة الخلية. في الخلايا T، IL-2 الإشارات عبر STAT5، وهو مطلوب لT خلية انتشار 12،13.
من أجل تحقيق التوسع نسيلي خلايا T تفعيلها، يجب أن تلك الخلايا التي لم تشهد مستضد TCR المشاركة (خلايا T ساذجة)، لديها آلية لتجاهل تأثيرات قوية من IL-2. ويتحقق ذلك عن طريق تنظيم وضع لونين. خلايا T ساذجة تمتلك ونين المكثف الذي يحظر إشراك-DNA STAT5 ردا على IL-2 التحفيز. عند التنشيط، يمكن decondenses لونين وSTAT5 الوصول إلى المروجين من الجينات المستهدفة، والسماح انتشار نسيلي 4. ومن المثير للاهتمام، وهذا التغيير في الوضع ونين لا يتوقف على تعديل جينية من هيستون من البروتيننانوثانية (للمراجعة، انظر 14) كما لاحظنا أي تغيير عالمي في تعديل هيستون خلال تنشيط الخلايا T 4.
أثناء أداء هذه الدراسات، اكتشفنا أن الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتينات هيستون زيارتها أيضا صعوبة في الوصول الحواتم في خلايا ساذجة، ولكن هذا على تنشيط يمكن ربط أكثر بسهولة الحواتم بها 4. وهكذا، الأجسام المضادة ملزمة لالهستونات بمثابة قراءات للحصول على مركز لونين التكثيف. هنا نقدم طريقة لاستخدام التدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة مترافق fluorescently هيستون H3 من أجل تقييم الوضع لونين في خلايا T. يتم قياس التكثيف لونين في عدد السكان من الخلايا كما كثافة يعني الإزهار (MFI) من هيستون H3 تلطيخ. في سياق T تنشيط الخلايا، ومؤسسات التمويل الأصغر من هيستون H3 زيادات تلطيخ، مما يدل على decondensation من لونين. بالإضافة إلى قياس وضع لونين عن طريق الخلايا هيستون H3 تلطيخ، incorpora هذا البروتوكول أيضاقسم التدريب والامتحانات سطح تلطيخ وصمة عار يمكن حلها عن الخلايا الحية، والسماح تحليل مجموعات سكانية فرعية من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضعنا البروتوكول الذي يسمح لتقييم التكثيف لونين في خلايا T. لأنه يعتمد على الملاحظة البسيطة أن الأجسام المضادة هيستون H3 لا يمكن الوصول لها بسهولة الحواتم في خلايا ساذجة، ولكن على تنشيط الخلايا T، هذه الأجسام المضادة نفسها قادرة على ربط الحواتم الخاصة بهم. بمقارنة مؤسسات التمويل الأصغر من هيستون H3 تلطيخ بين مجموعات العلاج، يمكن تحديد درجة نسبية من التكثيف أو decondensation. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتحديد حالة التكثيف النسبي خلال تطوير خلية توتية وخلال تنشيط الخلايا T 4. وقد استخدمنا أيضا هذا البروتوكول للتحقيق في الآليات التي تتحكم في عملية decondensation 5.
يعتمد هذا البروتوكول على استخدام الأجسام المضادة هيستون H3 للكشف عن وضع التكثيف لونين. لأنه ليس هناك أي تغيير عالمي في تعديل هيستون خلال T تنشيط الخلايا 4، ونحن قادرون على استخدام الأجسام المضادة H3K4me1 لتقييم لونينالوضع في هذا البروتوكول. وقد استخدمنا الأجسام المضادة التي أثيرت ضد معدلة هيستون H3؛ ومع ذلك، كانت إشارة المنتجة أضعف بكثير عموما. في تجربتنا، والأجسام المضادة التي أثيرت ضد تعديل هيستون H3 تعمل بشكل أفضل في المناعي والتدفق الخلوي المقايسات، في حين أن الأجسام المضادة ضد معدلة هيستون H3 تعمل بشكل أفضل في لطخة غربية. وتجدر الإشارة إلى أنه من الممكن أيضا استخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتينات هيستون أخرى، على الرغم من أننا لم يحاولوا ذلك.
بيرم / كتلة وهيستون H3 الخطوات الأجسام المضادة هي الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول. كمية من محلول بيرم / كتلة تستخدم يحتاج إلى أن يكون الأمثل في كل مرة يتم حل الأسهم بيرم. ويمكن أن يتم ذلك من خلال مقارنة أداء التخفيفات مختلفة من محلول المخزون. وتنطوي تجربة نموذجية مقارنة وضع لونين في خلايا T ساذجة لتلك تفعيلها لمدة 3 ساعة (الشكل 4). ينبغي للمرء أن يختار لتخفيف التي تنتج أكبر تغيير في مؤسسات التمويل الأصغر علىحللت الفترة الزمنية. يمكن تخفيفه الحل الأسهم في برنامج تلفزيوني + 2٪ لخفض بيرم / كتلة القوة عن طريق إعادة التعليق لأول مرة في خلايا بقدر 100 مل PBS + 2٪ بعد الخطوة 3.4 ثم إضافة بيرم / كتلة في الخطوة 3.5. وينبغي أن تستخدم تجربة رائدة مماثلة لاختبار التخفيفات مختلفة من fluorescently مترافق هيستون H3 الأجسام المضادة في كل مرة يتم المسمى دفعة جديدة من الأجسام المضادة. هذه الخطوات هي الحاسمة وخاصة لكشف الناجح الخلافات التكثيف في تنشيط الخلايا T في وقت مبكر (على سبيل المثال، في غضون 3 ساعات من التنشيط). في بعض الأحيان، وهناك الخلايا التي لا تحصل على permeabilized وبالتالي لن صمة عار مع الأجسام المضادة هيستون H3. قد يحدث هذا إذا لم يتم معلق الخلايا جيدا عند إضافة بيرم / كتلة أو إذا كان بيرم / كتلة ليست قوية بما فيه الكفاية. سوف تظهر هذه الخلايا عن الأحداث تضغط على محور عندما تصور رسم بياني لهيستون H3 تلطيخ. منذ هذه الأحداث سوف تحرف المؤسسة العامة، هذه الأحداث يمكن حذفها من التحليل من قبل gatinز توزيع الطبيعي للخلايا إيجابية هيستون H3. ويمكن الاطلاع على مساعدة إضافية في دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1).
إدراج وصمة عار الخلايا الميتة يمكن حلها يسمح لتقييم جدوى خلية في الفحص. هذا هو في غاية الأهمية عند التعامل مع تنشيط الخلايا T لأن بعض المحفزات يمكن أن تحفز موت الخلايا. في مثل هذه الحالة، يمكن أن الأجسام المضادة هيستون H3 ربط الهستونات في الخلايا الميتة مختلفة من الخلايا الحية، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج.
تم تصميم هذا البروتوكول للاستخدام في 96-جيدا شكل لوحة، والسماح للتحليل إنتاجية عالية من وضع لونين. وهناك الطحال من الماوس الإناث 6-8 اسبوع تسفر عادة بين 60 حتي 90000000 الخلايا باستخدام البروتوكول. منذ بروتوكول تلطيخ يتطلب 2 مليون خلية لكل عينة، يمكن للمرء بسهولة مقايسة مجموعات العلاج المتعددة ونقطة زمنية في ثلاث نسخ مع الطحال واحد على واحد لوحة 96-جيدا. فمن الممكن لصerform بروتوكول مع أقل خلايا لكل عينة. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى عدد من الخطوات الطرد المركزي وفقدان الكامنة في خلايا في كل خطوة من هذه الخطوات، فمن غير المستحسن لخفض عدد الخلايا بكثير. أكملنا بنجاح بروتوكول ب 1 مليون خلية لكل عينة.
استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة وضع لونين في CD4 + T الخلايا المساعدة والخلايا CD8 + T السامة للخلايا. وقد أصبح هذا ممكنا لأن البروتوكول يتضمن تلطيخ السطح القياسية. يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول لفحص لونين فى فئة اللمفاويات الأخرى باستخدام أجسام مضادة ضد علامات سطح السكان محددة. ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة هذا البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى طالما الأجسام المضادة الاعتراف علامات سطح ذات الصلة هي معروفة شروط تثبيت / permeabilization المتاحة والمناسبة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5 P20 RR016461 و 8 P20 GM103499)، المؤسسة الوطنية للعلوم (EPS-0903795). مزيد من الدعم المقدم من البحوث والفنية النمو جامعة فورمان والجوائز ميزة فرمان.
Materials
| 100mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| Precleaned frosted microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 3mL syringe, Luer-Lok tip | BD | 309585 | |
| Falcon 50mL polypropylene conical tube | Corning | 352098 | |
| LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit | Life Technologies | L23102 | Life Technologies sells versions of this kit with different colors |
| Fc Block | BD Biosciences | 553142 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Normal rabbit serum | Sigma-Aldrich | R9133 | |
| Anti-H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| R-Phycoerythrin conjugation kit | Abcam | ab102919 | Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used |
References
- Bravo-Ferrada, B. M., et al. Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration. J Appl Microbiol. , (2015).
- Agola, J. O., et al. Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein. Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).
- Toh, W. H., et al. Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations. Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).
- Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence. EMBO J. 30, 263-276 (2011).
- Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells. Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).
- Paul, W. E. . Fundamental immunology. , (2013).
- Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).
- Isakov, N., Altman, A. Protein kinase C(theta) in T cell activation. Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT. Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).
- Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. The JAK/STAT signaling pathway. J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).
- Ihle, J. N. STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell. 84, 331-334 (1996).
- Moriggl, R., et al. Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells. Immunity. 10, 249-259 (1999).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
