L'uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo di origine animale è stato approvato dal (numero permesso: A3242-01) Furman University Istituzionale Animal Care and Use Committee. Tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo si possono trovare nella tabella di materiali ed attrezzature, mentre i buffer utilizzati possono essere trovati nella tabella di buffer e soluzioni. 1. sospensione singola cella di linfociti da mouse milze Sacrifica topi tramite CO 2 asfissia. Confermare l'eutanasia da dislocazione cervicale. Nota: utilizzare la milza di due 6-8 settimane di età topi isogenico (ad esempio, C57B / 6) dello stesso sesso. In genere, due milze vengono elaborati. Spruzzare animali abbondantemente con soluzione etanolica al 70% e orientare tale che la testa è rivolto verso sinistra. Utilizzando pinze, sollevare la pelle dell'animale verso l'alto e lontano dal tegli corpo. Utilizzando le forbici, tagliare una piccola tacca attraverso la pelle vicino l'addome dell'animale. Usando le dita, tirare ciascun lato della tacca per esporre il peritoneo dal collo fino all'inizio delle zampe posteriori. La milza dovrebbe essere visibile direttamente sotto il peritoneo. Utilizzando pinze, sollevare il peritoneo e fare una piccola incisione per esporre la milza. Rimuovere la milza con una pinza e usare le forbici per prendere in giro via qualsiasi adiposo e tessuto connettivo. Posizionare la milza in un tubo da 50 ml contenente 10 ml di PBS integrato con il 2% siero fetale bovino (di seguito denominato PBS + 2%). Mantenere la provetta in ghiaccio fino al momento di iniziare la sospensione di cellule singole. Nota: recupero tipica è tra 60-90.000.000 cellule per la milza, e in genere, 2 milioni di cellule sono necessari per campione. Eseguite tutte le seguenti operazioni in una cappa coltura tissutale. Decantare la milza in una sterile 100 millimetri piatto di coltura tissutale. Ottenere due vetrini smerigliati e tenere tscivola in modo che le due superfici ruvide smerigliato faccia verso l'interno verso l'altra. Bagnare i vetrini nella soluzione PBS + 2% versato nella capsula di Petri. Tenere la milza tra le superfici dei vetrini smerigliati, con i bordi ancora sommerse, e macinare milza delicatamente spostando le diapositive e indietro uno contro l'altro (Figura 1A). Le cellule cadranno nella piastra di Petri. Continuare fino a quando tutte le cellule di macinazione sono stati rilasciati ed i resti della milza appare bianco (Figura 1B). Aspirare la sospensione cellulare in una pipetta e filtrare lentamente attraverso un filtro 70 micron in un nuovo tubo da 50 ml sterile. Si noti che piccoli pezzi di polpa rossa saranno presenti sul filtro (Figura 2A). Se il filtro si alza, delicatamente sollevarlo leggermente per consentire il fluido di defluire attraverso e inserire il filtro nel tubo conico da 50 ml e continuare, ripetendo questo processo, se necessario. Se il trattamento più di 5 spleente, può essere necessario dividere in due lotti e utilizzare un nuovo filtro per ogni. Utilizzando la porzione del tappo di una siringa da 3 ml premere delicatamente la polpa rossa contenente le cellule rimanenti attraverso il filtro (Figura 2B). Assicurati di premere sia il fondo del filtro e sui lati per garantire che tutti polpa rossa è passata attraverso il filtro (Figura 2C). Aggiungere 10 mlof PBS + 2% al piatto di coltura tissutale e usare questo per lavare la scivoli, siringa tappo, e piatto di recuperare tutte le cellule rimanenti. Passare questo attraverso lo stesso filtro di cella 70 micron nel tubo da 50 ml. Ripetere questa operazione, se necessario. Centrifugare la sospensione cellulare filtrato a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decantare delicatamente e scartare il surnatante, attenzione a non disturbare il pellet. Una traccia quantità di PBS + 2% sarà lasciato nel tubo. Tappare la provetta e flick il pellet fino a quando il pellet è completamente risospeso. Lisare globuli rossi di annuncioding 2 mL di ACK Lysis Buffer (0,15 M NH 4 Cl, 1 KHCO mM 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2, conservare a 4 ° C) per milza per tubo conico e ruotare e capovolgere il tubo per garantire che tutte le cellule entrare in contatto con il tampone ACK. Agitare delicatamente la provetta per 1 minuto a temperatura ambiente. Portare il volume della sospensione cellulare a 50 ml aggiungendo PBS + 2% il tubo di neutralizzare il buffer ACK. Invertire il tubo 10 volte e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. Dopo la centrifugazione è completa, il pellet dovrebbe essere bianco (Figura 3). Decantare delicatamente e scartare il surnatante, attenzione a non disturbare il pellet. Lascia una traccia quantità di PBS + 2% nel tubo, tappare la provetta, e sfogliare il pellet per sospendere di nuovo esso. Aggiungere 10 ml di mezzi T cellulari [10% FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 Glutamax mM, piruvato 1 mM sodio, aminoacidi non essenziali 1X, 1x penicillina / streptomicina e 50 mM β-mercaptoetanolo], e successive risospendere il pellet delicatamentepipettando su e giù. Poi filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro 70 micron in una nuova provetta da 50 ml. Utilizzare altri 5-10 ml di media di cellule T per sciacquare il tubo originale e passare questo attraverso il filtro 70 micron nella provetta contenente il resto delle celle filtrati. Se l'elaborazione più di due milze, il volume del supporto di cellule T può essere aumentata per massimizzare il recupero. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al momento di essere macchiato. Le cellule devono essere contati e la sostenibilità accessibili. Per contare le celle, unire 3 ml di cellule con 24 ml di PBS + 2% e 3 ml di 0,4% trypan blu. Carico 10 ml di questo in ciascuna camera di un migliorato emocitometro Neubauer. Viabilità, valutata mediante esclusione trypan blu, è in genere tra il 85-95%. 2. Viabilità e colorazione della superficie Cellule pellet di centrifugazione per 10 minuti a 300 xg a 4 ° C. Risospendere le cellule in mezzi cellule T ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml. Trasfer 2 milioni di cellule (100 ml) in un pozzetto di una 96-pozzetti di coltura tissutale U-fondo. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 10 minuti a 300 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante da ogni pozzetto muovendo liquido all'interno della piastra e nel lavandino (il pellet cellulare rimarrà nel pozzo) e tamponando la piastra su un tovagliolo di carta pulito. Lavare le cellule da essi risospendere in 200 microlitri di PBS seguita da centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eseguire tutte lava questo modo, se non diversamente indicato. Nota: Non utilizzare PBS + 2%, come essa possa interferire con la macchia PI risolvibile. Eliminare il surnatante tramite sfogliando la piastra e aggiungere 100 ml di colorante commerciale preparati al momento (ad esempio, macchia di cellule morte rosso fissabile) in ciascun pozzetto. Rendere la macchia diluendo il colorante soluzione madre reattiva 1:10 in DMSO seguita da una diluizione 1:10 in PBS. Incubare la piastra a 4 ° C per 30 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare la ptardi per 10 min a 300 xg a 4 ° C. A questo punto in avanti, eseguire tutti i lavori con la piastra con il cappuccio luce coltura di tessuti fuori. Eliminare il surnatante tramite sfogliando la piastra e poi aggiungere 100 ml di soluzione di blocco Fc. Fai la soluzione blocco Fc diluendo Fc soluzione blocco magazzino 1: 100 in PBS. Anticorpi diluire da utilizzare per la colorazione della superficie (ad esempio, anti-CD4 o anti-CD8) in PBS e aggiungere 100 ml di ogni bene. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 30 min a 4 ° C al riparo dalla luce. Nota: anticorpi macchia di superficie devono essere titolati per ottenere prestazioni ottimali. Utilizzano in genere una diluizione 1: 400, secondo il protocollo del produttore: 200 o 1. 3. intracellulare colorazione per istone H3 Dopo incubazione della macchia superficiale, lavare le cellule due volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 ml di paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti a temperatura ambiente. Fai paraformaldeide 4% per diluting 16% paraformaldeide in PBS. Fai di questo fresco. Lavare le cellule due volte in PBS. Preparare la soluzione Perm / blocchi (soluzione madre Perm è PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, conservare a 4 ° C) mediante la combinazione di 2 ml di siero di coniglio normale per 100 ml di soluzione madre di Perm. Fare abbastanza per 60 ml / campione. Aggiungere 40 ml di Perm / blocchi ad ogni pozzetto e mescolare bene pipettando gentilmente su e giù, facendo attenzione a non fare bolle. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 45 minuti al buio. Salvare restante Perm / blocchi per passo 3.6. Diluire fluorescente coniugato anticorpo istone H3K4me1 in soluzione Perm / blocchi riservato al punto 3.5 e aggiungere 10 ml di questa diluizione in ogni pozzetto. Mescolare pipettando gentilmente su e giù. Incubare la piastra a 96 pozzetti al buio per 1 ora a 4 ° C. Nota: utilizzare un anticorpo H3K4me1 coniugato utilizzando il kit di coniugazione R-Ficoeritrina seguendo le istruzioni del produttore. Lavare le cellule due volte in PBS + 2%. Risospendere le cellule in 200l di PBS + 2% e trasferire i campioni al tubi FACS per l'analisi di citometria a flusso. I campioni possono essere conservati a 4 ° C al buio. Per ottenere risultati ottimali analizzare i campioni entro due giorni. Singolarmente campioni colorati possono essere utilizzati come citofluorimetria controlli di compensazione.