Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Furman University Institutional Animal Care en gebruik Comite (Permit nummer: A3242-01). Alle materialen en apparatuur die wordt gebruikt in dit protocol is te vinden in de tabel van materialen en apparatuur, terwijl de buffers gebruikt kunnen worden gevonden in de tabel van Buffers en oplossingen. 1. enkele celsuspensie van lymfocyten van de muis Milten Offeren muizen via CO 2 stikken. Bevestig euthanasie door cervicale dislocatie. Opmerking: Gebruik de milt van twee 6-8 weken oude isogene muizen (bijv C57B / 6) van hetzelfde geslacht. Gewoonlijk worden twee milt verwerkt. Spray de dieren overvloedig met 70% ethanol-oplossing en oriënteren zodanig dat het hoofd naar links. Met behulp van een tang, til de huid van het dier omhoog en weg van tHij lichaam. Met een schaar, snijd een inkeping door de huid in de buurt van de buik van het dier. Met behulp van vingers, trekt elke zijde van de inkeping om het buikvlies van de hals blootstellen aan het begin van de achterpoten. De milt moet rechtstreeks zichtbaar zijn onder het buikvlies. Met behulp van een tang, til het buikvlies en maak een kleine incisie aan de milt bloot. Verwijder de milt met een tang en gebruik een schaar om weg te plagen elke vet- en bindweefsel. Plaats de milt in een 50 ml conische buis met 10 ml PBS aangevuld met 2% foetaal runderserum (hierna aangeduid als PBS + 2%). Houd de buis op ijs pas klaar om de enkele celsuspensie beginnen. Opmerking: Typisch herstel is tussen 60-90000000 cellen per milt, en typisch, zijn 2 miljoen cellen nodig per monster. Voer alle volgende stappen in een weefselkweek kap. Giet de milten in een steriele 100 mm weefselkweekplaat. Verkrijgen twee frosted microscoop dia's en houd thij glijdt zodat de twee ruwe matte oppervlakken naar binnen naar elkaar. Bevochtig de objectglaasjes in PBS + 2% oplossing gegoten in de petrischaal. Houd de milt tussen de matte oppervlakken van de dia met de randen nog steeds onder water, en maal de milt zachtjes bewegen van de schuiven en weer tegen elkaar (figuur 1A). De cellen in de petrischaal vallen. Verder malen totdat alle cellen is bekend en de overblijfselen van de milt wit lijken (Figuur 1B). Het opstellen van de celsuspensie in een pipet en filteren het langzaam door een 70 pm filter in een nieuwe steriele 50 ml conische buis. Merk op dat kleine stukjes rode pulp aanwezig op het filter (Figuur 2A) zal zijn. Als de filter stijgt, til deze iets omhoog om de vloeistof door middel van uitlekken en plaats het filter terug in de 50 ml conische buis en blijven, dit proces te herhalen als nodig is. Indien de verwerking van meer dan 5 spleens, kan het noodzakelijk zijn te verdelen in twee batches en gebruik een nieuwe filter voor elk. De stopper gedeelte van een spuit 3 ml druk de rode pulp met de overige cellen door de zeef (figuur 2B). Zorg ervoor dat het filter op zowel bodem en zijkanten zodat alle rode pulp door het filter (Figuur 2C). Voeg 10 mlof PBS + 2% de weefselkweekplaat en gebruiken om de glijbanen, spuit stop en schotel wassen om eventuele resterende cellen te herstellen. Passeert dit via dezelfde 70 micrometer cel zeef in de 50 ml conische buis. Herhaal dit indien nodig. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Voorzichtig decanteren en gooi de supernatant, Zorg dat u de pellet te verstoren. Een sporenhoeveelheid PBS + 2% wordt gelaten in de buis. Cap de buis en flick de pellet totdat de pellet volledig geresuspendeerd. Lyse rode bloedcellen door adding 2 ml ACK lyseerbuffer (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2, bewaren bij 4 ° C) per milt op de conische buis en draaien en keren de tube te zorgen dat alle cellen in contact met de ACK buffer. Zwenk de buis gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Breng het volume van de celsuspensie 50 ml door toevoeging van PBS + 2% van de buis naar de ACK buffer te neutraliseren. Inverteer de buis 10 maal en centrifugeer 5 min bij 300 xg bij 4 ° C. Na het centrifugeren voltooid, moet de witte pellet (Figuur 3) zijn. Voorzichtig decanteren en gooi de supernatant, Zorg dat u de pellet te verstoren. Laat een spoor hoeveelheid PBS + 2% in de buis, de dop op de tube en flick de pellet te resuspenderen. Voeg 10 ml T-celmedium [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, 1 mM natrium pyruvaat, 1X niet-essentiële aminozuren, 1 x penicilline / streptomycine en 50 mM β-mercaptoethanol], en verder resuspendeer de pellet door voorzichtigen neer te pipetteren. Filteren vervolgens de suspensie door een nieuwe 70 pm filter in een nieuwe 50 ml conische buis. Met een 5-10 ml T-celmedium met de oorspronkelijke buis te spoelen en geven deze door de 70 urn filter in het buisje met de rest van de gefilterde cellen. Indien voor meer dan twee milten, kan het volume van T-celmedium verhoogd tot terugwinning te maximaliseren. Houd cellen op ijs pas klaar om te worden gekleurd. De cellen moeten worden geteld en de levensvatbaarheid toegankelijk. Cellen tellen combineren 3 ml cellen met 24 ml PBS + 2% en 3 ml van 0,4% trypan blauw. Laad 10 ml van de in iedere kamer van een verbeterde Neubauer hemocytometer. Levensvatbaarheid, zoals vastgesteld door trypan blauw exclusie, ligt typisch tussen 85-95%. 2. levensvatbaarheid en Surface kleuring Pellet cellen door centrifugeren gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in T-celmedium met een concentratie van 1 x 10 7 cellen / ml. Transfer 2.000.000 cellen (100 ml) in een putje van een U-bodem 96-putjes weefsel kweekplaat. Centrifugeer de 96-well plaat gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant uit elk putje door de knop vloeistof in de wells plaat in de gootsteen (de celpellet wordt in de put blijven) en deppen de plaat op een schone papieren handdoek. Was de cellen door resuspenderen in 200 pi PBS, gevolgd door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Voer alle wassingen Zo tenzij anders vermeld. Opmerking: Gebruik geen PBS + 2% als het zal interfereren met de opgelapt PI vlek. Verwijder de bovenstaande vloeistof door de knop de plaat en voeg 100 ml vers bereide commerciële vlek (bijv fixable rode dode cellen vlek) aan elk putje. Maak de vlek door het verdunnen van de reactieve kleurstof 1:10 voorraadoplossing in DMSO gevolgd door een 1:10 verdunning in PBS. Incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 30 min beschermd tegen licht. Centrifugeer de plaat gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Op dit punt naar voren, voeren alle werken met de plaat met de weefselkweek kap licht uit. Verwijder de bovenstaande vloeistof door de knop de plaat en voeg vervolgens 100 ml Fc blok oplossing. Maak Fc blok oplossing door verdunning van Fc blok stock oplossing 1: 100 in PBS. Verdun antilichamen worden gebruikt voor oppervlakte kleuring (bijvoorbeeld anti-CD4 of anti-CD8) in PBS en voeg 100 ml in elk putje. Incubeer de 96-well plaat gedurende 30 min bij 4 ° C beschermd tegen licht. Opmerking: Oppervlakte vlek antilichamen worden getitreerd voor optimale prestaties. Typisch gebruik van een 1: 200 of 1: 400 verdunning per protocol van de fabrikant. 3. Intracellulaire kleuring voor histon H3 Na incubatie van het oppervlak vlek, was de cellen tweemaal in PBS. Na de laatste wasbeurt, voeg 100 ul van 4% paraformaldehyde aan elk putje. Incubeer de 96-well plaat gedurende 5 min bij RT. Maak 4% paraformaldehyde door diluting 16% paraformaldehyde in PBS. Maak dit vers. Was de cellen tweemaal in PBS. Maak Perm / Block-oplossing (voorraad Perm oplossing PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, op te slaan bij 4 ° C), door het combineren van 2 ml normaal konijnenserum per 100 ml bouillon Perm oplossing. Voeg voldoende voor 60 ml / monster. Voeg 40 ml Perm / Block aan elk monster goed en meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren, zorg ervoor dat u bellen te maken. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 45 min in het donker. Opslaan resterende Perm / Block voor stap 3.6. Verdun fluorescent geconjugeerd histon H3K4me1 antilichaam in Perm / Block oplossing gereserveerd stap 3,5 en voeg 10 ul van deze verdunning aan elk putje. Meng door zachtjes en neer te pipetteren. Incubeer de 96-well plaat in het donker gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: Gebruik een H3K4me1 antilichaam geconjugeerd met de R-fycoerythrine conjugatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Was de cellen tweemaal in PBS + 2%. Resuspendeer de cellen in 200gl PBS + 2% en breng de monsters FACS buizen voor flowcytometrie analyse. De monsters kunnen bij 4 ° C worden bewaard in het donker. Voor optimale resultaten te analyseren van de monsters binnen twee dagen. Afzonderlijk gekleurd monsters kunnen worden gebruikt als flowcytometrie compensatie controles.