השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי (מספר ההיתר: A3242-01) הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פורמן. ניתן למצוא את כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה בטבלה של חומרים וציוד, ואילו ניתן למצוא מאגרים משמשים בטבלה של חוצצים ופתרונות. 1. השעיה תא בודדת של ימפוציטים מטחול העכבר להקריב עכברים באמצעות CO 2 מחנק. לאשר המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם. הערה: השתמש בטחולים משני עכברים 6-8 שבוע ישנים isogenic (למשל, C57B / 6) מאותו המין. בדרך כלל, שני טחולים מעובדים. לרסס את בעלי החיים למכביר עם 70% אתנול ופתרון אוריינט כך שהראש פונה שמאלה. בעזרת מלקחיים, להרים את העור של החיה כלפי מעלה והרחק מtהוא הגוף. בעזרת מספריים, לחתוך חריץ קטן דרך העור ליד הבטן של החיה. שימוש באצבעות, למשוך כל צד של החריץ לחשוף את הצפק מהצוואר ועד לתחילת הרגליים האחוריות. הטחול צריך להיות גלוי ישירות מתחת לצפק. בעזרת מלקחיים, להרים את הצפק ולעשות חתך קטן כדי לחשוף את הטחול. הסר את הטחול עם מלקחיים ולהשתמש במספריים כדי להקניט משם כל שומן ורקמת חיבור. מניחים את הטחול לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS בתוספת 2% בסרום שור עוברי (להלן כPBS + 2%). שמור את הצינור על קרח עד מוכן להתחיל ההשעיה התא בודדת. הערה: התאוששות אופיינית היא 60-90 מיליון תאים לטחול, ובדרך כלל, 2 מיליון תאים דרושים לדגימה. לבצע את כל השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה. למזוג הטחולים לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ"מ סטרילי. להשיג שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית ולהחזיק tהוא מחליק כך ששני המשטחים החלבית מחוספס פנים פנימה לכיוון אחד לשני. להרטיב את השקופיות בפתרון + 2% PBS שפך לתוך צלחת פטרי. החזק את הטחול בין המשטחים החלבית של השקופיות, עם הקצוות עדיין שקועים, ולטחון את הטחול בעדינות על ידי העברת השקופיות קדימה ואחורה אחד נגד השני (איור 1 א). התאים ייפלו לתוך צלחת פטרי. המשך שחיקה עד שכל התאים שוחררו והשרידים של הטחול להופיע לבנים (איור 1). צייר את ההשעיה התא בpipet ולסנן אותה באיטיות דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי חדש 50 מיליליטר חרוטי. שים לב שחתיכות קטנות של עיסה אדומה תהיה נוכחת במסנן (איור 2 א). אם המסנן עולה, בעדינות להרים אותו מעט כדי לאפשר לנוזל להתנקז דרך ולמקם את המסנן בחזרה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהמשיך, לחזור על תהליך זה במידת צורך. אם עיבוד יותר מ -5 spleENS, ייתכן שיהיה צורך לחלק לשתי קבוצות ולהשתמש במסנן חדש עבור כל אחד. שימוש בחלק הפקק של מזרק 3 מיליליטר לחץ בעדינות את העיסה האדומה המכילה את התאים שנותרו במסננת (איור 2). הקפד ללחוץ שתי תחתית המסנן וצדדים כדי להבטיח שכל העיסה האדומה עברה דרך המסנן (איור 2 ג). הוסף 10 mlof + 2% PBS לצלחת תרבית הרקמה ולהשתמש בזה כדי לשטוף את השקופיות, פקק מזרק, ומנה לשחזר את כל תאים שנותרו. להעביר את זה דרך אותה מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. חזור על שלב זה במידת הצורך. צנטריפוגה ההשעיה התא המסוננת ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. בעדינות למזוג וזורקים supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור. עקבות סכום של 2% PBS + יישאר בצינור. שווי הצינור וקפיצי גלולה עד גלולה היא resuspended לחלוטין. תאי דם אדום Lyse ידי מודעהדינג 2 מ"ל של ACK תמוגה מאגר (0.15 מ 'NH 4 Cl, 1 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.2, חנות ב 4 ° C) לטחול לצינור חרוטי ולסובב ולהפוך את הצינור כדי להבטיח שכל התאים באים במגע עם חיץ ACK. מערבולת בעדינות את צינור דקות 1 ב RT. תביא את הנפח של ההשעיה תא 50 מיליליטר על ידי הוספת PBS + 2% הצינור לנטרל את חיץ ACK. להפוך את הצינור 10 פעמים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה היא מוחלטת, גלולה צריכה להיות לבן (איור 3). בעדינות למזוג וזורקים supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור. השאר עקבות סכום של PBS + 2% בצינור, מכסה את הצינור, וקפיצי גלולה לresuspend זה. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת T תא [10% FBS, 10 מ"מ HEPES (pH 7.0), 2 מ"מ Glutamax, פירובט 1 מ"מ נתרן, חומצות אמינו לא חיוניות 1X, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 מ"מ β-mercaptoethanol], ועוד resuspend גלולה ידי בעדינותpipetting למעלה ולמטה. אז לסנן את ההשעיה דרך מסנן 70 מיקרומטר חדש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. שימוש נוסף 5-10 מיליליטר של תקשורת תא T לשטוף את הצינור המקורי ולהעביר את זה דרך המסנן 70 מיקרומטר לתוך הצינור המכיל את שאר התאים המסוננים. אם עיבוד יותר משני טחולים, הנפח של תקשורת תא T יכול להיות מוגבר על מנת למקסם את ההתאוששות. שמור את התאים על קרח עד מוכן להיות מוכתמים. יש לספור תאים וכדאיות גישה. לספור תאים, לשלב 3 מיליליטר של תאים עם 24 מיליליטר של PBS + 2% ו- 3 מיליליטר של 0.4% trypan כחולים. טען 10 מיליליטר של זה לכל תא של hemocytometer נויבאואר השתפר. כדאיות, כפי שהוערך על ידי הרחקת trypan הכחולה, היא בדרך כלל בין 85-95%. 2. יכולת הקיום והכתמת Surface תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים בתקשורת תא T לריכוז של 1 x 10 7 תאים / מיליליטר. Transfאה 2 מיליון תאים (100 מיליליטר) לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 96-גם תחתית-U. צנטריפוגה הצלחת 96-היטב במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מכל טוב ידי מצליף נוזל בתוך הצלחת גם לכיור (התא גלולה יישאר בבאר) ומספיג את הצלחת על מגבת נייר נקייה. לשטוף את התאים על ידי resuspending אותם ב200 μl PBS ואחריו צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע את כל שטיפות בדרך זו, אלא אם כן צוין אחרת. הערה: אל תשתמש בPBS + 2% כפי שיפריע לכתם PI ניתן לתקן. הסר את supernatant ידי מצליף הצלחת ולהוסיף כתם של מוכן טרי מסחרי (למשל, כתם תא ניתן לתקן אדום מת) לכל 100 מיליליטר היטב. הפוך את הכתם על ידי דילול 01:10 פתרון מניות צבע תגובתי בDMSO אחרי דילול 1:10 ב PBS. דגירה את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מוגנות מפני אור. צנטריפוגה עמ 'מאוחר במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בנקודה זו קדימה, לבצע את כל העבודה עם הצלחת עם מכסה המנוע אור תרבית רקמה מ. הסר את supernatant ידי מצליף הצלחת ולאחר מכן להוסיף לפתרון בלוק Fc 100 מיליליטר. הפוך פתרון בלוק Fc על ידי דילול מניות פתרון בלוק Fc 1: 100 ב- PBS. נוגדנים לדלל לשמש לצביעת משטח (למשל, אנטי CD4 או אנטי CD8) בPBS ולהוסיף 100 מיליליטר לכל טוב. דגירה צלחת 96-היטב במשך 30 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור. הערה: נוגדני כתם משטח צריכים להיות titered לביצועים אופטימליים. בדרך כלל משתמש בדילול 1: 400, לפרוטוקול של היצרן: 200 או 1. 3. תאיים מכתים להיסטון H3 לאחר דגירה של כתם המשטח, לשטוף את התאים פעמים PBS. לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף של paraformaldehyde 4% 100 μl היטב כל אחד. דגירה צלחת 96-היטב במשך 5 דקות על RT. הפוך paraformaldehyde 4% על ידי diluting paraformaldehyde 16% ב- PBS. להפוך את זה טרי. לשטוף את התאים פעמים PBS. הפוך פתרון פרם / חסום (פתרון פר המניה הוא PBS + 2% + 0.02% Triton X-100, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס) על ידי שילוב של 2 מיליליטר של סרום ארנבת רגיל לכל 100 מיליליטר פתרון פר מניה. לעשות מספיק עבור 60 מיליליטר / מדגם. הוסף 40 מיליליטר פר / חסום לכל דגימה היטב ומערבבים היטב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, נזהר שלא לעשות בועות. דגירה את הצלחת על RT במשך 45 דקות בחושך. להציל את שנותר פרם / חסום לצעד 3.6. לדלל נוגדן היסטון H3K4me1 fluorescently מצומדות בפתרון פרם / חסום שמורות בשלב 3.5 ולהוסיף 10 μl של דילול זה לכל אחד. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה צלחת 96-היטב בחושך במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: השתמש בנוגדן H3K4me1 מצומדת באמצעות ערכת נטיית R-Phycoerythrin הבא הוראות היצרן. לשטוף את התאים פעמים PBS + 2%. Resuspend התאים 200μl PBS + 2% ולהעביר את הדגימות לצינורות FACS לניתוח cytometry זרימה. ניתן לאחסן הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. לקבלת תוצאות אופטימליות לנתח הדגימות בתוך יומיים. ביחידים דגימות מוכתמות יכולות לשמש כcytometry זרימת בקרות פיצוי.