El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo animal fue aprobado por el (número de permisos: A3242-01) Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Furman. Todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales y Equipos, mientras tampones utilizados se pueden encontrar en la tabla de tampones y soluciones. 1. suspensión de células individuales de linfocitos del mouse bazos Sacrificar los ratones mediante asfixia con CO2. Confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Nota: Utilice el bazo a partir de dos 6-8 semanas de edad ratones isogénico (por ejemplo, C57B / 6) del mismo género. Por lo general, se procesan dos bazos. Rocíe los animales profusamente con solución de etanol al 70% y orientar de manera que la cabeza está mirando hacia la izquierda. El uso de pinzas, levantar la piel del animal hacia arriba y lejos de tque cuerpo. Con unas tijeras, corte una pequeña muesca a través de la piel cerca del abdomen del animal. Usando los dedos, tirar de cada lado de la muesca para exponer el peritoneo desde el cuello hasta el comienzo de las patas traseras. El bazo debe ser visible directamente debajo del peritoneo. Con unas pinzas, levante el peritoneo y hacer una pequeña incisión para exponer el bazo. Retirar el bazo con pinzas y usar las tijeras para embromar a la basura cualquier adiposo y tejido conectivo. Coloque el bazo en un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de PBS suplementado con 2% suero bovino fetal (denominado en lo sucesivo PBS + 2%). Mantenga el tubo en hielo hasta que esté listo para comenzar la suspensión de células individuales. Nota: la recuperación típica es de entre 60-90 million células por el bazo, y por lo general, se necesitan 2 millones de células por muestra. Realizar todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos. Decantar los bazos en un 100 mm placa de cultivo tisular estéril. Obtener dos portaobjetos esmerilado y mantenga tse desliza de manera que las dos superficies heladas en bruto se enfrentan hacia el interior uno hacia el otro. Moje las diapositivas en la solución de PBS + 2% se vierte en la placa de Petri. Mantenga el bazo entre las superficies de esmerilado de las diapositivas, con los bordes todavía sumergidas, y moler el bazo suavemente moviendo las diapositivas de ida y vuelta uno contra el otro (Figura 1A). Las células caerán en la placa de Petri. Continuar moler hasta que todas las células han sido liberados y los restos del bazo aparecerá blanco (Figura 1B). Elaborar la suspensión celular en una pipeta y filtrar lentamente a través de un filtro de 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml estéril. Tenga en cuenta que pequeños trozos de pulpa roja estarán presentes en el filtro (Figura 2). Si el filtro se levanta, levántelo ligeramente para permitir que el líquido drene a través y coloque el filtro en el tubo cónico de 50 ml y continuar, repitiendo este proceso según sea necesario. Si el procesamiento de más de 5 SPLEens, puede ser necesario dividir en dos lotes y utilizar un nuevo filtro para cada uno. El uso de la parte de tope de una jeringa de 3 ml presionar suavemente la pulpa roja que contiene las células restantes a través del filtro (Figura 2B). Asegúrese de presionar tanto a la parte inferior del filtro y los lados para asegurar que toda la pulpa roja ha pasado a través del filtro (Figura 2C). Añadir 10 mL de PBS + 2% a la placa de cultivo de tejidos y usar esto para lavar el portaobjetos, tapón de la jeringa, y el plato para recuperar las células restantes. Pasar este a través del mismo filtro de células de 70 m en el tubo cónico de 50 mL. Repita este paso según sea necesario. Centrifugar la suspensión celular se filtró a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante, con cuidado de no perturbar el sedimento. Una cantidad traza de PBS + 2% se dejó en el tubo. Tapar el tubo y la película de la pastilla hasta que el sedimento se resuspendió completamente. Lyse glóbulos rojos por anuncioding 2 ml de ACK tampón de lisis (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH de 7,2, se almacena a 4 ° C) por bazo al tubo cónico y girar e invertir el tubo para asegurar que todas las células entrar en contacto con el tampón ACK. Agite suavemente el tubo durante 1 min a TA. Llevar el volumen de la suspensión celular a 50 ml mediante la adición de PBS + 2% el tubo para neutralizar el tampón ACK. Invierta el tubo 10 veces y centrifugar durante 5 minutos a 300 xga 4 ° C. Después de la centrifugación es completa, el sedimento debe ser blanco (Figura 3). Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante, con cuidado de no perturbar el sedimento. Deja una pequeña cantidad de PBS + 2% en el tubo, tapar el tubo, y la película de la pastilla para volver a suspender la misma. Añadir 10 ml de medio de células T [10% de FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, piruvato 1 mM de sodio, 1x aminoácidos no esenciales, 1x penicilina / estreptomicina y 50 mM β-mercaptoetanol] y, además, resuspender el precipitado por suavementepipeteando arriba y abajo. Luego filtrar la suspensión a través de un filtro de 70 micras nuevo en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Utilice otros 5-10 ml de medio de células T para enjuagar el tubo original y pasar esta a través del filtro 70 micras en el tubo que contiene el resto de las células filtradas. Si el procesamiento de más de dos bazos, el volumen de los medios de comunicación de células T se puede aumentar para maximizar la recuperación. Mantener las células en hielo hasta que esté listo para ser manchado. Las células deben ser contados y viabilidad acceder. Para contar las células, combinar 3 ml de células con 24 ml de PBS + 2% y 3 ml de 0,4% de azul de tripano. Cargar 10 ml de esta en cada cámara de un hemocitómetro Neubauer mejorado. Viabilidad, según la evaluación de exclusión con azul de tripano, es típicamente entre 85 a 95%. 2. Viabilidad y tinción de la superficie Células de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 300 xga 4 ° C. Resuspender las células en medio de células T a una concentración de 1 x 10 7 células / ml. Transfer 2 millones de células (100 ml) en un pocillo de una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo en U. Centrifugar la placa de 96 pocillos durante 10 minutos a 300 xga 4 ° C. Eliminar el sobrenadante de cada pocillo con un movimiento rápido de líquido dentro de la placa así en el fregadero (el sedimento celular se mantendrá en el pozo) y secándose la placa sobre una toalla de papel limpia. Lavar las células mediante resuspensión en 200 l de PBS seguido de centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Realizar todos los lavados de esta manera a menos que se indique lo contrario. Nota: No utilice PBS + 2%, ya que interfiere con la mancha PI puede arreglar. Eliminar el sobrenadante con un movimiento rápido de la placa y añadir 100 ml de tinte comercial recién preparado (por ejemplo, se puede fijar la mancha roja de células muertas) a cada pocillo. Hacer la mancha por dilución de la solución de colorante reactivo 01:10 en DMSO seguido de una dilución 1:10 en PBS. Incubar la placa a 4 ° C durante 30 min protegidas de la luz. Centrifugar la ptarde para 10 min a 300 xga 4 ° C. En este punto en adelante, realice todo el trabajo con la placa con la luz campana de cultivo de tejidos fuera. Eliminar el sobrenadante con un movimiento rápido de la placa y luego añadir 100 ml de solución de bloqueo Fc. Hacer solución de bloqueo Fc diluyendo Fc bloque de solución madre 1: 100 en PBS. Diluir anticuerpos que se utilizarán para tinción de la superficie (por ejemplo, anti-CD4 o anti-CD8) en PBS y se añaden 100 ml a cada pocillo. Incubar la placa de 96 pocillos durante 30 minutos a 4 ° C protegido de la luz. Nota: Los anticuerpos manchas superficiales deben titularon para un rendimiento óptimo. Típicamente utilizar una dilución 1: 400, por el protocolo del fabricante: 200 o 1. 3. intracelular Histona H3 tinción para Después de la incubación de la mancha de la superficie, se lavan las células dos veces en PBS. Después del último lavado, añadir 100 l de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Incubar la placa de 96 pocillos durante 5 min a TA. Hacer 4% de paraformaldehído por diluting 16% de paraformaldehído en PBS. Haga este fresco. Lavar las células dos veces en PBS. Hacer solución de Perm / Bloque (solución madre Perm es PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, se almacenan a 4 ° C) mediante la combinación de 2 ml de suero normal de conejo por 100 ml de la solución de Perm. Hacer suficiente para 60 ml / muestra. Añadir 40 ml de Perm / Bloquear a cada pocillo de muestra y mezclar bien con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 45 min en la oscuridad. Ahorre restante Perm / Bloque para el paso 3.6. Diluir anticuerpo conjugado con fluorescencia Histona H3K4me1 en Perm / Bloque solución reservado en el paso 3.5 y añadir 10 l de esta dilución a cada pocillo. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar la placa de 96 pocillos en la oscuridad durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Utilice un anticuerpo conjugado H3K4me1 utilizando el kit de conjugación R-ficoeritrina siguiendo las instrucciones del fabricante. Lavar las células dos veces en PBS + 2%. Resuspender las células en 200l de PBS + 2% y transferir las muestras a tubos FACS para citometría de flujo análisis. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C en la oscuridad. Para obtener resultados óptimos analizar las muestras dentro de los dos días. Individualmente las muestras teñidas se pueden utilizar como citometría de flujo controles de compensación.