Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi İlkelerine uygun olarak, yerel Hayvan Bakım Komitesi yönetmeliğine uygun olarak ele alınır. Sıçanlar, (21-22 ºC sıcaklık ve% 40-50 nem) ayrı ayrı sabit koşullarda muhafaza edilir 08:00 am başlayan, 12 saat karanlık-aydınlık döngüsünün dahil. Chow pelet ve musluk suyu çalışma boyunca ad libitum. Tedarikçi tarafından doğum sonrası 3 günlük bir alışma dönemi deney öncesi izin verilir. 300-800 g arasında olan erkek Sprague-Dawley sıçanları rutin olarak bu protokol ile kullanılmıştır. 1. MI Cerrahisi Ketamin 60 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi neden. Pençeleri sıkışmak zaman refleksinin yokluğu ile doğru anesthetization onaylayın. Cerrahi siteyi Tıraş. (16G 1.77 inç) kateter ve lateral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin: endotrakeal tüp ile entübe sıçan. Sıcaklık yaklaşık 37 ° C tutmak için bir ısıtma pedi üzerine hayvanlar koyun. % 2 izofluran endotrakeal tüp bağlayın. Klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile cerrahi siteyi hazırlayın. Ameliyat sırasında steril eldiven ve steril aletler kullanın. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için her iki göze oftalmik merhem sürün. Hayvan ve hayvan yanındaki başka bir steril alanında araçlara steril alan yerleştirin. Neşter bıçak # 10 ile cildi İnsizyon. Hemostatik kelepçe ile kas dokusu soyulabilir. Ventral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin. Hemostatik kelepçe ve pozisyon göğüs Retraktörü Açık göğüs duvarı. Hemostatik kelepçe ile Açık perikard. Bitişik miyokard dokusu geçerek, koroner oklüzyon, döngü inen koroner arterin etrafında 360 mm uzunluğunda 4-0 ipek sütür üretmek. Bir 14G, 1,25 cm uzunluğunda plastik tüp içine ipek sütür her iki ucunu yerleştirin. Ipek sütür ve irin iki ucunu çekinh aşağı arterin karşı tüp 40 dakika, bunu tıkanması için. Bir hemostatik kelepçe ile plastik tüp sıkma ile Güvenli tıkanıklığı. 40 dakika sonra, esnek boru ve ipek dikiş çıkarılarak hazırlanabilir hemostatik kelepçe, serbest tarafından oklüzyonu bırakın. Not: Sham kontrol fareler aynı cerrahi prosedür eksi koroner arter tıkanıklığı uğrarlar. Torasik duvar kapatmadan önce, pnömotoraks önlemek için 5 ml şırınga ile toraks havayı dışarı çekmek için göğüs boşluğundan esnek bir kateter (18G, 4.5 cm) yerleştirin. Kapat toraks boşluğu 2-0 sütür ile, 4-0 ipek sütür ile kas ve 3-0 ipek sütür ile cilt dikiş. Geçen cilt noktasını kapatmadan önce, yine göğüs boşluğuna önce yerleştirilmiş kateter ile 5 ml şırınga ile toraks havayı çizin. Geçen cilt noktasını dikin. Izofluran havalandırma durdurun. Sıçan uyanış izleyin. O Regaine olana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınd yeterli bilinç sternum yatma korumak için. Bir antibiyotik ile bir analjezik (buprenorfin, 0,05 mg / kg ip) ile 24 saat (duplocillin tek bir dozu, 0.2 mg / kg ip) için sıçana her 8 saat tedavi edin. Ameliyattan sonra, ev fareleri tek tek, yani kurban zamanına kadar, 3 gün sonrası MI. Enfarktüs büyüklüğü, özellikle nekroz sol ventrikülün risk altındaki alanlarda bulunan enfarktlı doku oranı olarak ifade edilir. Bu trifeniltetrazolyum renklenme 11 kullanılarak ölçülür olabilir. 2. Amygdala İzolasyon Onun burnu dar olan uç açıklığı dışarı çıkıntılı, bir koni şeklinde çanta içinde ilk hayvan kafası yerleştirin. Güvenli sıçan herhangi bir hareketi önlemek için. Makas bıçakları arasında, giyotin üzerinde uygun başını yerleştirin. Hayvan başını kesmek. Bir tabak sıçan Yeri başkanı ezilmiş buz tuttu. Ezilmiş buz (4 ° C) doku olarak ayırma işlemleri gerçekleştirir. Cut açık skull makasla dikkatlice yukarı çekerek ve altındaki dokuyu yaralama kaçınarak kemik rongeurs kemik kılıfları ayırmak. Kafatasının alt ve beynin posterior ventral yüzeyi arasında bir spatula düz bıçağı yerleştirin ve dikkatlice beyin yavaşça dışarı kaldırdı olabilir kadar yavaşça kafatasının alt kısmı boyunca ileriye doğru bıçağı iterek kafatası beyin ayırmak kafatası. Kafatası atın. Dorsal yüzeyinde beyin yerleştirin. Hipotalamus (beyincik önünde yapısını) tanımlamak ve ön ucu ve arka ucu önünde ve arkasında koronale beyin kesmek; diğer kullanımlar için gerekli değilse beynin ön ve arka bölümlerini atmak. Hemen yanında hipotalamus, bilateral, temporal lob altında küçük küreler olarak amygdalas gözünüzde canlandırın. Uzakta deneyci gelen, onun ön ucundaki dorsal yüzeyini beyin düz çevirin. Beynin sol veya sağ tarafı ile başlayın. Hemi ayırınDaha sonra küreler ve mücavir amigdala gelen korteks. Amigdala izolasyonunu sağlamak için bu gevşek korteksin yolu yaklaşık 8 mm kesin. Neşter ile amigdala kesip. Karşıya çalışan karanlık sütür, neredeyse yarı yarıya boyunca keserek kendi centromedial kısmından amigdala bazolateral kısmını ayırın. Bu yapı her zaman kolayca tanımlanabilir değildir. Ayrı tespit şişelerde amigdala alt parçalarının koyun ve ezilmiş buz üzerinde tutmak. Diğer yarımkürede ile tekrarlayın diseksiyon prosedürü. 1 dakika süre ile sıvı azot içinde şişeleri bırakın. Ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C dondurucu içinde flakonu tutun. 3. Kaspaz-3 Aktivite Sukroz 0.32 M,% 1 Triton-X-100, Tris-HCI, pH 8, etilendiamintetraasetik asit 5 mM, ditiyotreitol 2 mM, fenilmetilsülfonil fluorür, 1 mM, leupeptin, 10 ug / ul 10 mM liziz tamponu , pepstatin A 10 mg / ml aprotinin, 10 ug / ml. Her numune (5-10 mg), lizis tamponu 150 ul ekle. Buz üzerinde tutun. Maksimal şiddette (40 W) 5 saniye boyunca buz üzerinde her örnek sonikasyon. 30 dakika boyunca buz üzerinde liziz tamponunda doku inkübe edin. Vorteks 5 dakika boyunca her bir numune. Alternatif olarak sıvı azot içinde ve 37 ° C'de ayarlanmış bir termostatik olarak kontrol edilen ısıtma plakası üzerinde numuneler yerleştirilerek 3 donma / çözülme devrelerine gerçekleştirin. 13.000 g Santrifüj doku (4 10 dakika boyunca ° C). Dikkatle süpernatant kaldırmak ve buz üzerinde tüp içinde tutmak. Büyükbaş hayvan serum albümini ile 0 ve 10 ug / ml arasında, standart protein konsantrasyonları hazırlayın. Sadece tampon maddesi ile boşlukları hazırlayın. Her standart Bradford reaktifi 200 ul ekle. 595 nm standart okuyun. Protein seviyeleri için, damıtılmış su içinde 795 | il Bradford reaktifi 200 ul numune süpernatan 5 ul ekleyin. 595 nm'de her bir örnek okuma ve standart eğri ile protein miktarı belirlenir. 5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCI, pH 7, <reaksiyon tamponu hazırlayın/ sub>, etilen glikol tetraasetik asit, 1 mM, 3-kolamidopropil% 0.1) dimetilamonyo] -1-propansülfonat ve ditiotreitol, 1 mM. Pozitif ve negatif reaktif örnekleri elde etmek reaksiyon tamponu ve kaspaz-3 yüzeylerde proteinin 25 ug ekleyin. Negatif numuneler için, proteinin 25 ug, Ac-DEVD-CHO 800 uM 0.4 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul reaksiyon tamponu ilave edin. Pozitif örnekler için, reaksiyon tamponu proteinin 25 ug ve Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul ekle. Üç nüsha halinde tüm negatif ve pozitif örnekleri işleyin. Reaksiyon tamponu ilave edilerek 200 ul kadar Her numunenin son hacim tamamlanması. Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0.5 ul, 0.8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM liziz tamponu 10 ul reaksiyon tampon maddesi 188,7 ul ekleyerek negatif kontrolleri üretir. Pozitif kontroller için, reaksiyon tamponu 189.2 ul, Ac-DEVD-AMC 10 mM, 0.8 ul lizis tamponu 10 ul ekle. Örnekleri inkübe ve37 O ° C'de 3 saat süreyle karanlıkta kontroller Her bir numune ve kontrol 600 ul 0.4 M glisin ve NaOH 0.4 M (pH 10) ile reaksiyonu durdurun. 465 nm, 365 nm ve emisyon dalga uyarma dalga boyunda spectrofluorometry ile floresan ölçmek. Bir cam küvet içinde reaksiyona damıtık su 2 ml ilave edilir. Her saniyede 1 puan 10 saniye boyunca kontrolleri ve numuneleri okuyun. Her bir örnekte spesifik aktivitesi niceliğini: ((negatif numuneler eksi pozitif örneklerin floresan) 2,8 ml x hacim floresan) (Protein 25 mg inkübasyon 3 saat x miktarı zaman) bölünmesidir.