心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

動物は動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに従って、地元の動物ケア委員会の規制に準拠して処理される。ラットは、（21〜22ºCの温度と40〜50％の湿度）個別に一定の条件下で飼育されています08:00から始まる、12時間明暗サイクルを含みます。チョウペレットと水道水は、研究を通して自由に摂取されています。サプライヤーによる送達後3日間の馴化期間は、実験前に許可されています。 300〜800グラムの体重の雄性Sprague-Dawleyラットは、日常このプロトコルで使用されてきました。 1. MI手術ケタミン60 mgの/ kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内注射で麻酔を誘導します。足が挟まれているときに反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。 手術部位を剃ります。 （16G 1.77インチ）をカテーテルと側臥位で動物を配置します。気管内チューブを挿管ラット。 37℃前後の温度を維持するために加熱パッドの上に動物を配置します。 2％イソフルランする気管内チューブを接続します。 グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルアルコールで手術部位を準備します。手術中、滅菌手袋、滅菌機器を使用しています。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。動物や動物の隣に別の滅菌フィールド上の機器に滅菌フィールドを置きます。 手術用メスの刃＃10で皮膚を切開。止血クランプで筋肉組織をはがし。腹臥位の位置に動物を配置します。止血クランプ位置の胸の開創と胸壁を開きます。止血クランプで開く心膜。 連続した心筋組織を通過し、下降冠状動脈の周りの冠動脈閉塞、ループ360ミリメートル長4-0絹縫合糸を製造することができます。 14G 1.25 cmの長さのプラスチックチューブに絹縫合糸の両端を挿入します。 絹縫合糸と膿の両端を引いhは動脈に対するダウンチューブを40分間、それを閉塞します。止血クランプでプラスチックチューブをクランプすることによって閉塞を固定します。 40分後、フレキシブルチューブ、絹縫合糸を除去した止血クランプを、解放することによって閉塞を解除します。 注：シャム対照ラットには同じ外科的処置のマイナス冠状動脈の閉塞を受けます。 胸壁を閉じる前に、気胸を防ぐために、5 mlのシリンジを用いて胸部から空気を描画するために胸腔を通して柔軟なカテーテル（18G 4.5センチ）を配置。 2-0縫合糸で閉じる胸部空洞、4-0絹縫合糸と3-0絹縫合糸で皮膚と筋肉をステッチ。 最後のスキンポイントを閉じる前に、再び胸部キャビティ内にあらかじめ配置されたカテーテルを通して5 mlのシリンジを用いて胸部から空気を引き出します。 最後のスキンポイントを縫合。イソフルラン換気を停止します。 ラットの覚醒を監視します。それはregaineを有するまで無人の動物を放置しないでくださいD十分な意識は胸骨横臥位を維持します。 鎮痛剤（ブプレノルフィン、0.05ミリグラム/ kg、腹腔内）で抗生物質（duplocillinの単回投与、0.2ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを24時間毎に8時間を扱います。 手術後、家のラット個別に屠殺時まで、 すなわち 、3日後にMI。 梗塞サイズ、主に壊死は、左心室の危険性のある領域における梗塞組織の割合として表されます。これは、トリフェニル着色11を用いて測定することができます。 2.扁桃体の分離その鼻は狭い端部の開口部の外に突出して、円錐形のバッグの中に最初の動物の頭を置きます。あらゆる動きを避けるために、ラットを固定します。はさみの刃の間に、ギロチンに適切にその頭を置きます。動物の首を切ります。 皿にラットの頭部を置き、砕いた氷の上に保持。砕いた氷（4℃）で組織分離のためのすべての手順を実行します。 カットオープンSK慎重に引き上げと下の組織をmutilating回避することにより、骨鉗子で骨シースを切り離し、ハサミでULL。 頭蓋骨の底部と脳の後部腹側表面との間にヘラの平らな刃を置き、慎重に脳をゆっくり外に持ち上げることができるようになるまで静かに頭蓋骨の底部に沿って前方に刃を押して、頭蓋骨から脳を切り離し頭蓋骨。頭蓋骨を捨てます。 その背側表面に脳を置きます。視床下部（小脳の前の構造）を特定し、その前端の、その後端の前後に冠状脳をカット。他の用途のために必要とされていない場合、脳の前方および後方部分を破棄します。 ちょうど次の視床下部に、左右対称に、側頭葉の下に小球としてamygdalasを視覚化。 離れ実験者からの正面の端に脳フラットフリップ、背面。 脳の左側または右側から開始します。ヘミを分離球体して、連続した扁桃体からの皮質。扁桃体の単離を可能にするために、この緩い皮質の方法8mm程度をカットします。メスで扁桃体を切り取ります。 それ横切る暗い縫合糸に沿って切断することにより、そのcentromedial部分から扁桃体の基底外側の部分を分離し、ほぼ半々。この構造は、常に容易に識別ではありません。 個別の識別されたバイアル中に扁桃体のサブパーツを入れて、砕いた氷の上におきます。 他の半球で解剖手順を繰り返します。 1分間液体窒素中でバイアルを浸し。必要になるまで-80℃の冷凍庫にバイアルをしてください。 3.カスパーゼ-3活性スクロースの0.32 Mで溶解緩衝液を調製し、1％トリトンX-100、トリス-HCl、pH8の10mMのエチレンジアミン四酢酸の5 mMのジチオスレイトール、2 mMの、フェニルメチルスルホニルフルオリド1mMの、ロイペプチン10μgの/μL 、ペプスタチンAの10μgの/μLおよびアプロチニン10μgの/μL。 各サンプル（5〜10mgの）に溶解バッファー150μlのを追加します。氷の上に保管してください。最大強度（40 W）で5秒間、氷上で超音波処理し、各サンプル。 30分間氷上で溶解緩衝液中で組織をインキュベートします。 5分間、各サンプルをボルテックス。 液体窒素および37℃に設定したサーモスタット制御加熱プレート上で交互にサンプルを配置することによって、3回の凍結/融解サイクルを行います。 13,000gで遠心組織（4 10分間°C）。注意深く上清を除去し、氷上でチューブに保ちます。 ウシ血清アルブミンを0と10μg/ mlの間で標準的なタンパク質濃度を準備します。緩衝液のみで空白を準備します。 各規格にBradford試薬200μlのを追加します。 595 nmにおける標準読みます。タンパク質レベルでは、蒸留水795μlのブラッドフォード試薬の200μlにサンプル上清の5μlを添加します。 595nmで各サンプルを読み、標準曲線を有するタンパク質を定量化します。 5mMのMgCl 2、50mMのトリス-HCl、pHが7、<との反応緩衝液を調製します/サブ>、エチレングリコール四酢酸1mMの、3-cholamidopropylの0.1％）ジメチル] -1-プロパン及びジチオスレイトール1mMの。 正と負の反応サンプルを得るために反応緩衝液およびカスパーゼ3基質に25μgのタンパク質を追加します。負のサンプルについて、25μgのタンパク質は、AC-DEVD-CHO 800μMの0.4μLとのAc-DEVD-AMCの10mMの0.8μlを、反応バッファーを追加します。正のサンプルでは、​​反応緩衝液に25μgのタンパク質とのAc-DEVD-AMCの10mMの0.8μlを添加します。三重ですべての負と正のサンプルを処理します。反応緩衝液を添加することによって、200μlのまで各試料の最終容量を完了します。 Ac-DEVD-CHO 800μMの0.5μL、0.8μLのAc-DEVD-AMCの10mM、溶解緩衝液の10μlに反応緩衝液の188.7μLを追加することで、ネガティブコントロールを生成します。陽性対照のために、反応緩衝液189.2μlのAC-DEVD-AMCの10mM、溶解緩衝液10μlを0.8μlを添加します。 サンプルをインキュベートし、37 O℃で3時間暗所でのコントロール各サンプルとコントロールに600μlのグリシン、0.4MのNaOHと0.4 M（pHが10）との反応を停止します。 465ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長で蛍光分光分析によって蛍光を定量化します。ガラスキュベット中の反応に2mlの蒸留水を追加します。各秒に1点で10秒間コントロールとサンプルをお読みください。 各試料中の特定の活動を定量化：（陰性サンプルマイナス陽性サンプルの蛍光（蛍光）2.8ミリリットルの容量をX）（タンパク質25ミリグラムのインキュベーション3時間のX量の時間）で割りました。