كاسباس 3 النشاط في الفئران اللوزة تقاس Spectrofluorometry بعد احتشاء عضلة القلب
Summary
Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Abstract
احتشاء عضلة القلب (MI) لديه مثيرة متوسطة وطويلة الأجل عواقب على الصعيدين الفسيولوجية والسلوكية، ولكن الآليات التي تشارك لا تزال غير واضحة. وقد وضعت لدينا مختبر نموذج الفئران من متلازمة ما بعد-MI التي تعرض وظائف ضعف القلب، وفقدان الخلايا العصبية في الجهاز الحوفي، العجز المعرفي والسلوكي علامات الاكتئاب. على مستوى الخلايا العصبية، كاسباس 3 تفعيل يتوسط بعد MI موت الخلايا المبرمج في المناطق الحوفي مختلفة، مثل اللوزة – وتبلغ ذروتها في 3 أيام بعد MI. العاهات المعرفية والسلوكية تظهر 2-3 أسابيع بعد MI وهذه ترتبط إحصائيا مع تدابير كاسباس 3 النشاط. يستخدم بروتوكول صفها هنا للحث MI، جمع الأنسجة اللوزة وقياس كاسباس 3 النشاط باستخدام spectrofluorometry. للحث على MI، والمغطي الشريان التاجي تنازلي لمدة 40 دقيقة. بروتوكول لتقييم كاسباس 3 تفعيل يبدأ بعد 3 أيام MI: يتم التضحية الفئران واللوزة معزولة RAPIDLY من الدماغ. يتم تجميد العينات بسرعة في النيتروجين السائل والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى التحليل الفعلي. وتستند هذه التقنية القيام بها لتقييم كاسباس 3 التنشيط على الانقسام ركيزة (DEVD-AMC) من خلال كاسباس 3، التي تصدر مجمع الفلورة التي يمكن أن تقاس spectrofluorometry. المنهجية الكمية واستنساخه ولكن المعدات المطلوبة مكلفة وإجراءات لقياس العينات هو مضيعة للوقت. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى الأنسجة الأخرى، مثل القلب والكلى. DEVD-AMC يمكن الاستعاضة عن ركائز أخرى لقياس نشاط caspases أخرى.
Introduction
Caspases أو البروتياز الموجه اسبارتاتي سيستين التي تعتمد هي عائلة من الإنزيمات التي تشارك في مختلف العمليات التي التوازن 1. Caspases يمكن تصنيفها وفقا لدورهم في موت الخلايا المبرمج أو التهاب. ويشارك كاسباس 1، -4، -5 و-12 في التهاب في حين أن أولئك الذين يعملون في الخلايا يمكن أن يكون شبه تصنف على أنها caspases البادئ (كاسباس 8 و -9) وcaspases الجلاد (كاسباس 3، -6 -7 و ).
Caspases تلعب أدوارا مهمة في العديد من الأمراض، لا سيما في الاضطرابات التي موت الخلايا المبرمج يمكن أن يكون مبالغا فيه، كما لوحظ بعد احتشاء عضلة القلب (MI) أو نقص التروية الدماغية.
في نموذج الفئران من متلازمة ما بعد MI المستخدمة في المختبر، وثبت أن يتم تنشيط كاسباس 3 ليس فقط في عضلة القلب 2 ولكن أيضا في الجهاز الحوفي الذي تورط في السيطرة على المزاج والعواطف 3-6. وينظر أيضا أن يتم تنشيط كاسباس 3 في مناطق مختلفةمن الجهاز الحوفي، مثل اللوزة وقرن آمون، وهذا التنشيط قمم حوالي 3 أيام بعد إهانة الدماغية 4. ومن المثير للاهتمام، يرتبط كاسباس 3 النشاط مع مرحلة ما بعد MI الإعاقات السلوكية، والتوهين من خلال التدخلات الدوائية والغذائية يقلل من هذه الإصابات، مما يشير إلى احتمال وجود صلة بين كاسباس 3 وبعد MI الاكتئاب 7-12.
ويمكن قياس كاسباس 3 التنشيط من خلال تقنيات مختلفة. النشاف الغربي أيقن خصائص الأنزيمية للcaspases ويمكن الكشف عن الانزيمات النشطة فضلا عن أشكال المؤيدة للانزيم بهم. النشاف الغربي، ومع ذلك، هو شبه الكمي، ويمكن أن تضيع الاختلافات الصغيرة من خلال إشارة ضعيفة إلى الضوضاء نسب 13. ويستند أسلوب أفضل على الانقسام ركيزة (DEVD-AMC) من خلال كاسباس 3 التي تطلق مجمع الفلورة ويمكن أن يقاس spectrofluorometry. كاسباس 3 التنشيط هو علامة موثوقة من موت الخلايا المبرمج. قياس موت الخلايا المبرمج كاليفورنيان يكون غير مستقر بسبب النافذة وقت حدوثها قصير، والخلايا المجاورة يمكن أن phagocytize الهيئات أفكارك أو خلايا 14. موت الخلايا المبرمج يمكن تأكيد مزيدا من التقنيات الأخرى، مثل محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز وسم نهاية dUTP نيك (النفق) مقايسة، الذي يكشف تجزئة DNA الناتجة من أجهزة الطرد المركزي أفكارك الإشارات 6، أو نسبة من البروتينات الموالية / المضادة للأفكارك، مثل باكس / Bcl2 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
تجربتنا مع هذا البروتوكول على مدى السنوات ال 10 الماضية أدت إلى تحديد القضايا المنهجية حرجة. أولا، تشريح الدماغ السريع في طبق بيتري على الثلج المجروش مهم للحفاظ على جودة الإعداد. ثانيا، يجب أن تتحقق أن صوتنة الأنسجة أقصر لاللوزة الدماغية مقارنة مع أنواع أخرى من الأنسجة، مثل القلب (10 ثانية) أو الكلى (20 ثانية). ثالثا، يجب توخي الحذر الشديد لخلط بعناية الركيزة قبل إضافتها إلى العينات. واجهنا إشارات متباينة عندما كان تسلسل خلط غير كافية. رابعا، ينبغي أن يكون هناك فقاعات موجودة في الخلية الكوارتز عند قراءة العينات. خلاف ذلك، يمكن أن تتغير الإشارة.
نحن إجراء تغيير في السنوات القليلة الماضية لزيادة استنساخ النتائج: زيادة حجم الركيزة لتجنب حجم أقل من 1 ميكرولتر. ومع ذلك، قد تحدث اختلافات صغيرة بين المقايسات المتعاقبة، وينبغي أن تستخدم ما لا يقل عن 3 عينات التحكم لتحكم عن الاختلافات. وبلغ متوسط التدابير مضان من هذه الضوابط ويتم تعيين الوسيط عند 100٪. يتم تحويل التدابير مضان في عينات تجريبية في المئة من العينات السيطرة.
قيود آخر من التقنية هو وأنه ليس هناك سوى جزء من نسيج يستخدم، وبالتالي، يمكن الاستهانة كاسباس 3 النشاط. في الواقع، النافذة وقت موت الخلايا المبرمج قصيرة في أي خلية معينة، ويمكن أن تضيع على الرغم من أنه يحدث في المناطق المجاورة في وقت أخذ العينات 1،4،15. العكس هو الممكن أيضا: الخلايا يمكن أن تكون مكثفة وخاصة في أجزاء من الأنسجة، مما أدى إلى المبالغة في تقدير كاسباس 3 النشاط. من المستحسن استخدام الأنسجة المتبقية (اللوزة) لتقنيات تكميلية، مثل فحوصات TUNEL أو نسبة باكس / Bcl2 (انظر المقدمة).
Spectrofluorometry اثنين على الأقل من المزايا أكثر من النشاف الغربي. أولا، فإنه يقوم مباشرة البيانات الكمية. ثانيا، أنه يقيس الأنزيمية لctivity نفسها بدلا من البروتين أو RNA التعبير، والتي قد تكون غير ذات صلة، وأنه من المعروف أن بروتين تعبير يمكن زيادة دون أي تغيير في النشاط الأنزيمي. وعلاوة على ذلك، spectrofluorometry لا يمكن أن يؤديها على الأنسجة الأخرى أو مع مختلف أنواع الحيوانات ويمكن تعديلها لفرعية كاسباس أخرى، مع ركائز مختلفة، بحيث مقارنات آمنة ويمكن إجراء.
في الختام، يوضح هذا المستند استخدام spectrofluorometry لقياس كاسباس 3 النشاط في اللوزة، وتوفير الأدلة يحدث أن موت الخلايا المبرمج في هذه المنطقة من الجهاز الحوفي بعد 3 أيام MI.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا كيم جيلبرت يحمل studentship من فون للبحوث كيبيك – سانتيه.
Materials
| Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
| Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
| Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
| Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
| Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |
References
- Denault, J. B., Salvesen, G. S. Caspases: keys in the ignition of cell death. Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).
- Boucher, M., et al. Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).
- Kaloustian, S., et al. Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala. Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).
- Kaloustian, S., et al. Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat. Brain Research. 1216, 87-91 (2008).
- Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).
- Wann, B. P., et al. Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat. Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).
- Arseneault-Breard, J., et al. Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model. British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).
- Bah, T. M., et al. Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression. Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).
- Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction. Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).
- Gilbert, K., et al. Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion. British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).
- Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression. Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).
- Wann, B. P., et al. Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline. Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).
- Gorr, T. A., Vogel, J. Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues. Proteomics: Clinical Applications. , (2015).
- McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. ‘Killing the blues’: a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response. Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell. 102, 1-4 (2000).
