Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

בעלי חיים מטופלים בעמידה ברגולציה של ועדת הטיפול בבעלי חיים המקומית, בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. חולדות שוכנו בנפרד בתנאים קבועים (טמפרטורה של 21-22 מעלות צלזיוס ולחות של 40-50%), כולל מחזור כהה אור 12 שעות, מתחיל בשעה 08:00 בבוקר. כדורי צ'או ומים ברז הם כרצונך מודעה זמין לאורך כל תקופת המחקר. תקופת התאקלמות של 3 ימים לאחר לידה על ידי הספק מותר לפני הניסוי. חולדות זכרי Sprague-Dawley משקל בין 300-800 גר היו בשימוש באופן שיגרתי עם פרוטוקול זה. 1. ניתוח MI לגרום להרדמה עם זריקות intraperitoneal של 60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם xylazine. אשר הרדמה תקינה על ידי היעדר רפלקס כאשר כפות הם צבטו. לגלח אתר כירורגית. צנרר עכברוש עם צינורות endotracheal: צנתר (16G 1.77 אינץ ') ולמקם את החיה בעמדת פַּחֶסֶת רוחב. מניחים את בעלי החיים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס. חבר את צינורות endotracheal לIsoflurane 2%. הכן אתר כירורגית עם gluconate chlorhexidine ואלכוהול איזופרופיל. במהלך ניתוח, להשתמש בכפפות סטריליות ומכשירים מעוקרים. החל משחת עיניים לשני העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. שים שדה סטרילי על בעלי חיים ועל המכשירים אחר שדה סטרילי בסמוך לבעלי החיים. לחתוך את עור עם להב סכין מנתחים # 10. לקלף את רקמת שריר עם מהדק עוצר דמום. מניחים את החיה בעמדת פַּחֶסֶת הגחון. קיר בית חזה פתוח עם מפשק חזה מהדק ומיקום עוצר דמום. קרום הלב פתוח עם מהדק עוצר דמום. כדי לייצר חסימה כלילית, לולאת תפר משי 4-0 מ"מ 360-ארוך סביב העורקים הכליליים יורדים, עובר דרך רקמת שריר לב רציפה. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי ל14g, צינור פלסטיק ארוך 1.25 סנטימטר. משוך את שני הקצוות של תפר המשי ומוגלהh הצינור נחלש כנגד העורק כדי לחסום אותו, במשך 40 דקות. חסימה מאובטחת על ידי הידוק צינור הפלסטיק עם מהדק עוצר דמום. אחרי 40 דקות, לשחרר את החסימה על ידי שחרור המהדק עוצר דמום, ואחריו הסרת תפר צינורות ומשי גמיש. הערה: חולדות שליטה שאם עוברות את אותו הליך כירורגי מינוס החסימה של העורקים הכליליים. לפני סגירת קיר בית החזה, מקום צנתר גמיש (18G, 4.5 סנטימטרים) בחלל בית החזה לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ"ל כדי למנוע pneumothorax. חלל בית החזה לסגור עם 2-0 תפר, לתפור את השריר עם תפר 4-0 משי ועור עם 3-0 תפר משי. לפני סגירת נקודת העור שעברה, שוב לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ"ל באמצעות הצנתר ממוקם בעבר בחלל בית החזה. לתפור נקודת עור שעברה. תפסיק אוורור isoflurane. צג התעוררות חולדה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד יש Regaineתודעה מספיק ד לשמור כיבתה sternal. פנק את חולדה כל שעה 8 לשעה 24 עם משכך כאבים (עצירות, 0.05 מ"ג / IP קילוגרם) ועם אנטיביוטיקה (מנה אחת של duplocillin, 0.2 מ"ג / IP קילוגרם). לאחר הניתוח, חולדות בית בנפרד עד זמן הקרבה, כלומר, 3 ימים לאחר אוטם לבבי. גודל אוטם, בעיקר נמק, מתבטא בשיעור של רקמת אוטם שריר באזור בסיכון של החדר השמאלי. זה יכול נמדד באמצעות צבע triphenyltetrazolium 11. 2. בידוד האמיגדלה מניחים את ראש החיה ראשונה בתיק בצורת חרוט, עם אפה הבולט מתוך צמצם הקצה הצר. עכברוש מאובטח כדי למנוע כל תנועה. מקם את ראשה כראוי על הגיליוטינה, בין להבי המספריים. לערוף חיה. ראש מקום החולדה בצלחת כל הזמן על קרח כתוש. לבצע את כל ההליכים לבידוד רקמות על קרח כתוש (4 מעלות צלזיוס). SK הפתוח לחתוךull עם מספריים, לנתק בזהירות נדני עצם עם rongeurs עצם על ידי משיכת והימנעות פציעת הרקמה מתחת. מניחים את להב השטוח של מרית בין החלק התחתון של הגולגולת ומשטח הגחון האחורי של המוח ולנתק בזהירות מוח מגולגולת על ידי דחיפה קלה של הלהב קדימה לאורך החלק התחתון של הגולגולת עד שהמוח יכול להיות הרים לאט מ גוּלגוֹלֶת. מחק את הגולגולת. מניחים מוח על פני השטח הגב שלה. לזהות ההיפותלמוס (מבנה בחזית של המוח הקטן) ולחתוך את מוח coronally מול הקצה הקדמי שלה ומאחורי הקצה האחורי שלה; השלך את החלקים הקדמי והאחוריים של המוח, אם אין צורך לשימושים אחרים. דמיין amygdalas כמו כדורים קטנים מתחת האונה הטמפורלית, דו-צדדי, רק בסמוך להיפותלמוס. הפוך את שטוח המוח בסוף הקדמי שלה, משטח הגבי מהניסוי. התחל עם צד שמאלי או ימני של המוח. הפרד את חמיתחומים ולאחר מכן הקליפה מהאמיגדלה רציפה. חותך דרך כ -8 מ"מ של זה רופף קליפה כדי לאפשר בידוד של האמיגדלה. לחתוך אמיגדלה עם אזמל. לבודד את החלק של basolateral האמיגדלה מחלק centromedial על ידי חיתוך לאורך התפר הכהה שחוצה אותו, כמעט חצי וחצי. מבנה זה לא תמיד קל לזיהוי. שים subparts האמיגדלה בבקבוקונים מזוהים נפרדים ולשמור על קרח כתוש. הליך נתיחה חוזר עם חצי הכדור האחר. לטבול את הבקבוקונים בחנקן נוזלי דקות 1. שמור בקבוקון במקפיא -80 ° C עד צורך. 3. caspase-3 פעילות הכן מאגר תמוגה עם 0.32 M של סוכרוז, 1% Triton-X-100, 10 מ"מ של טריס-HCl, pH 8, 5 מ"מ של חומצת ethylenediaminetetraacetic, 2 מ"מ של dithiothreitol, 1 מ"מ של פלואוריד phenylmethylsulfonyl, 10 מיקרוגרם / μl של leupeptin , 10 מיקרוגרם / μl של pepstatin ו -10 מיקרוגרם / μl של aprotinin. להוסיף 150 μl של חיץ תמוגה לכל דגימה (5-10 מ"ג). שמור על קרח. Sonicate כל דגימה על קרח למשך 5 שניות בעוצמה מקסימלי (40 W). דגירה רקמה במאגר תמוגה על קרח למשך 30 דקות. וורטקס כל מדגם למשך 5 דקות. לבצע מחזורי 3 הקפאה / הפשרה על ידי הצבת דגימות לסירוגין בחנקן נוזלי ועל צלחת חימום תרמוסטטית שליטה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס. רקמת צנטריפוגה ב 13,000 ז (4 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות. מוציא בזהירות supernatant ולשמור בצינור על קרח. הכן ריכוזי חלבון סטנדרטיים בין 0 ל 10 מיקרוגרם / מיליליטר עם אלבומין בסרום שור. הכן את החסר עם חיץ בלבד. הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד לכל תקן. קראו סטנדרטי ב595 ננומטר. לרמות חלבון, להוסיף 5 μl של supernatant המדגם לμl 795 של מים מזוקקים ו -200 μl של מגיב ברדפורד. קראו כל דגימה ב595 ננומטר ולכמת חלבון עם עקומה סטנדרטית. הכן חיץ תגובה עם 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7, 5 מ"מ של MgCl 2 </ Dimethylammonio] -1-propanesulfonate משנה>, 1 מ"מ של חומצת tetraacetic אתילן גליקול, 0.1% מ3-cholamidopropyl) ושל 1 מ"מ dithiothreitol. הוסף 25 מיקרוגרם של חלבון למצעי חיץ התגובה וcaspase-3 להשיג דגימות תגובה חיוביות ושליליות. עבור דגימות שליליות, להוסיף למאגר תגובה, 25 מיקרוגרם של חלבון, 0.4 μl של מיקרומטר Ac-DEVD-CHO 800 וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ. לדגימות חיוביות, להוסיף 25 מיקרוגרם של חלבון למאגר תגובה וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ. לעבד את כל הדגימות השליליות וחיוביות בשלושה עותקים. השלם את הנפח הסופי של כל דגימה עד 200 μl על ידי הוספת תגובת חיץ. לייצר בקרה שלילית על ידי הוספת 188.7 μl של חיץ תגובה ל 0.5 μl של Ac-DEVD-CHO 800 מיקרומטר, 0.8 μl Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. לבקרות חיוביות, להוסיף 189.2 μl של חיץ תגובה, 0.8 μl של Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. דגירה דגימות ובקרות בחושך במשך 3 שעות על 37 מעלות צלסיוס קצות עם 600 גליצין μl 0.4 מ 'ו -0.4 NaOH M (pH 10) בכל דגימה ושליטה. לכמת הקרינה על ידי spectrofluorometry בגל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​465 ננומטר. הוסף 2 מיליליטר של מים מזוקקים לתגובה בקובט זכוכית. קראו בקרות ודגימות למשך 10 שניות עם נקודה 1 בכל שנייה. לכמת פעילות ספציפית בכל דגימה: ((הקרינה של דגימות שליליות מינוס הקרינה של דגימות חיוביות) x נפח של 2.8 מיליליטר) מחולקים ב( זמן דגירה 3 כמות x שעות של חלבון 25 מ"ג).