Активность каспазы-3 в миндалевидного тела крыс Измеряется спектрофлюориметре после инфаркта миокарда
Summary
Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Abstract
Инфаркт миокарда (ИМ) имеет драматические средне- и долгосрочные последствия на физиологических и поведенческих уровнях, но механизмы, участвующие по-прежнему неясны. Наша лаборатория разработала крысиной модели синдрома после ИМ, который отображает нарушениями сердечной функции, потерю нейронов в лимбической системе, познавательные дефициты и поведенческие признаки депрессии. В нейронов уровне, каспазы-3 активации посредником после MI апоптоз в различных лимбических регионах, таких как миндалины – с максимумом на 3-й день после ИМ. Когнитивные и поведенческие нарушения появляются через 2-3 недели после инфаркта миокарда, и эти корреляции статистически с мерами каспазы-3. Протокол, описанный здесь, используется, чтобы вызвать инфаркт миокарда, собирать миндалины ткани и измерить активность каспазы-3 с использованием спектрофлюориметре. Для индукции MI, нисходящая коронарной артерии окклюзии в течение 40 мин. Протокол оценки каспазы-3 активации начинается через 3 дня после инфаркта миокарда: крыс забивали и миндалевидное тело изолированы RAPIжественной от мозга. Образцы быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до фактического анализа. Методика Для оценки каспазы-3 активацию на основе расщепления субстрата (DEVD-AMC) по каспазы-3, который выпускает флуорогенный соединение, которое может быть измерено на спектрофлюориметре. Методология количественной и воспроизводимым, но оборудование, необходимое является дорогостоящим и процедура количественной оценки образцов отнимает много времени. Этот метод может быть применен к другим тканей, таких как сердце и почки. DEVD-AMC могут быть заменены другими субстратами для измерения активности других каспаз.
Introduction
Каспазы или цистеин-зависимых аспартат-протеазы направлены семья ферментов, которые участвуют в различных гомеостаза ПРОЦЕССОВ 1. Каспазы можно подразделить в соответствии с их ролями в апоптозе или воспаления. Каспазы-1, -4, -5 и -12 участвуют в воспалении, тогда как те, кто занимается апоптоза может быть подразделены на инициатора каспаз (каспазы-8 и -9) и палач каспазы (каспазы-3, -6 и -7 ).
Каспазы играют важную роль во многих патологий, в основном, в котором апоптоз расстройств может быть чрезмерным, так как наблюдается после инфаркта миокарда (ИМ) или ишемией головного мозга.
В крысиной модели синдрома после инфаркта миокарда, используемой в нашей лаборатории, будет установлено, что каспазы-3 активируется не только в миокарде 2, но и в лимбической системы, которая участвует в контроле настроения и эмоций 3-6. Видно также, что каспазы-3 активируется в различных регионахлимбической системы, такие как миндалины и гиппокампа, и эта активация пиков около 3 дней после ишемического инсульта 4. Интересно, что активность каспазы-3 коррелирует с постинфарктных поведенческих нарушений, и ее затухание через фармакологических вмешательств и питательные уменьшает эти травмы, предполагая возможную связь между каспазы-3 и пост-MI депрессии 7-12.
Каспазы-3 активации может быть измерена с помощью различных методик. Вестерн-блоттинг констатирует ферментативные свойства каспаз и может обнаружить активные ферменты, а также их про-фермента формы. Вестерн-блоттинга, однако, полу-количественная и небольшие изменения могут быть потеряны через слабые соотношениях 13 сигнал-шум. Более методика основана на расщеплении субстрата (DEVD-AMC) по каспазы-3, которая выпускает флуорогенный соединение и может быть измерена на спектрофлюориметре. Каспазы-3 активации является надежным маркером апоптоза. Измерение апоптоза окп неустойчиво, потому что время появления окна коротка, а соседние клетки могут фагоцитируют апоптоза клеток тела или 14. Апоптоз может быть дополнительно подтверждено другими методами, такими как терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы дУТФ ник конец маркировка (TUNEL) анализа, который обнаруживает фрагментацию ДНК в результате апоптоза сигнальных каскадов 6, или отношение про- / Антиапоптозный белков, таких как Bax / Bcl2 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш опыт работы с этим протоколом в течение последних 10 лет привели к выявлению критических методологических вопросов. Во-первых, быстрое рассечение мозга в чашке Петри на дробленый лед является важным для поддержания качества подготовки. Во-вторых, необходимо понимать, что ткани ультразвуком короче для головного миндалины по сравнению с другими типами тканей, таких как сердце (10 сек) или почек (20 сек). В-третьих, большое внимание должно быть принято, чтобы тщательно перемешать субстрат перед добавлением его к образцам. Мы столкнулись переменных сигналов, когда смешивание последовательность была недостаточной. В-четвертых, не было пузырей должен присутствовать в кварцевую кювету при чтении образцы. В противном случае, сигнал может быть изменен.
Мы внесли изменения в последние несколько лет, чтобы увеличить воспроизводимость результатов: увеличение объема субстрата, чтобы избежать объем менее 1 мкл. Тем не менее, небольшие изменения могут возникать между последовательными анализами, и по крайней мере 3 контрольные образцы должны быть использованы дляуправления изменениями. Флуоресцентные меры этих элементов управления в среднем и средняя установлен на 100%. Флуоресцентные меры экспериментальных образцов трансформируются в процентах от контрольных образцов.
Другим ограничением метода является то, что только часть ткани используется, и, следовательно, активность каспазы-3 может быть недооценен. Действительно, временное окно апоптоза коротка в любой данной клетке и может быть пропустил, хотя это происходит в соседних областей во время отбора проб 1,4,15. Обратное также возможно: апоптоз может быть особенно интенсивным в частях ткани, в результате чего завышению каспазы-3. Мы рекомендуем использовать оставшиеся ткани (миндалины) для дополнительных методов, таких как TUNEL анализов или отношение Вах / Bcl2 (см введение).
Спектрофлюориметре имеет по крайней мере два преимущества перед Вестерн-блоттинга. Во-первых, непосредственно создает количественные данные. Во-вторых, он измеряет ферментативный AСам, а не белка или РНК выражение, которое может быть не связан, и известно, что экспрессия белка может быть увеличена без изменения ферментативной активности ctivity. Кроме того, спектрофлюориметре может быть выполнена на другие ткани или разных видов животных и могут быть приспособлены для других подтипов каспаз, с различными субстратами, так что безопасные сравнения могут быть сделаны.
В заключение, этот документ демонстрирует использование спектрофлюориметре измерить активность каспазы-3 в миндалине, что свидетельствует, что апоптоза в этой области лимбической системы через 3 дня после инфаркта миокарда.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. Эта работа была поддержана грантом от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады Ким Гилберт имеет аспирантуру из Fonds де-ла-Recherche дю Квебек – Santé.
Materials
| Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
| Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
| Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
| Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
| Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |
References
- Denault, J. B., Salvesen, G. S. Caspases: keys in the ignition of cell death. Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).
- Boucher, M., et al. Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).
- Kaloustian, S., et al. Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala. Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).
- Kaloustian, S., et al. Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat. Brain Research. 1216, 87-91 (2008).
- Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).
- Wann, B. P., et al. Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat. Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).
- Arseneault-Breard, J., et al. Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model. British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).
- Bah, T. M., et al. Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression. Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).
- Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction. Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).
- Gilbert, K., et al. Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion. British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).
- Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression. Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).
- Wann, B. P., et al. Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline. Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).
- Gorr, T. A., Vogel, J. Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues. Proteomics: Clinical Applications. , (2015).
- McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. ‘Killing the blues’: a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response. Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell. 102, 1-4 (2000).
