Caspase-3 activiteit in het Rat Amygdala Gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct

Dieren worden behandeld in overeenstemming met de regelgeving van de lokale Animal Care Committee, in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care. Ratten zijn gehuisvest individueel onder constante condities (temperatuur van 21-22 ° C en vochtigheid van 40-50%), waaronder een 12 uur donker-licht cyclus, te beginnen om 08:00. Chow pellets en kraanwater zijn ad libitum gedurende het onderzoek. Een acclimatisatie periode van 3 dagen na levering door de leverancier is toegestaan ​​voor het experiment. Mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht tussen 300-800 g werden routinematig gebruikt met dit protocol. 1. MI Surgery Induceren anesthesie met intraperitoneale injecties van ketamine 60 mg / kg en xylazine 10 mg / kg. Bevestig de juiste verdoving door de afwezigheid van reflex wanneer de poten worden geknepen. Scheren operatiewond. Intuberen rat met endotracheale slangen: catheter (16G 1,77 inch) en plaats van dieren in de laterale decubitus positie. Plaats de dieren op een verwarmingselement om de temperatuur rond de 37 ° C te houden. Sluit de endotracheale slang aan isofluraan 2%. Bereid chirurgische site met chloorhexidinegluconaat en isopropylalcohol. Tijdens de operatie, gebruik steriele handschoenen en gesteriliseerde instrumenten. Breng oogzalf beide ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Zet steriele veld op dieren en de instrumenten op een andere steriele veld naast het dier. Incise huid met een scalpel # 10. Afpellen spierweefsel met een hemostatische klem. Plaats het dier ventrale decubitus positie. Open thoracale muur met een hemostatische klem en de positie van de borst oprolmechanisme. Open hartzakje met een hemostatische klem. Coronaire occlusie, lus produceert een 360 mm lange 4-0 zijden hechtdraad rondom de dalende kransslagader, die door de aangrenzende myocardweefsel. Steek beide uiteinden van de zijden hechtdraad in een 14G, 1,25 cm lange plastic buis. Trek beide uiteinden van de zijden hechtdraad en push de buis naar beneden tegen de slagader om het af te sluiten, gedurende 40 min. Veilig occlusie door klemmen de plastic buis met een hemostatische klem. Na 40 min, laat de occlusie door het vrijgeven van de hemostatische klem, gevolgd door het verwijderen van de flexibele slang en de zijden hechtdraad. Opmerking: Sham controle ratten dezelfde operatie minus de occlusie van de kransslagader ondergaan. Voordat de borstwand, een flexibel katheter (18G, 4,5 cm) tot de borstholte om lucht te trekken uit de thorax met een 5-ml spuit om pneumothorax voorkomen. Sluiten thorax holte met 2-0 hechtdraad, steek de spier met 4-0 zijden hechtdraad en de huid met 3-0 zijden hechtdraad. Voor het sluiten van de laatste huid punt weer trekken lucht uit de thorax met 5-ml spuit door de katheter die eerder in de thorax holte geplaatst. Hechtdraad laatste huid punt. Stoppen isofluraan ventilatie. Monitor rat ontwaken. Heeft een dier niet onbeheerd laten staan ​​totdat het Regained voldoende bewustzijn borstligging handhaven. Behandel rat elke 8 uur gedurende 24 uur met een pijnstiller (buprenorfine, 0,05 mg / kg ip) en een antibioticum (een enkelvoudige dosis duplocillin, 0,2 mg / kg ip). Na de operatie, huis ratten individueel op het moment van het offer, dat wil zeggen, 3 dagen na MI. Infarctgrootte, voornamelijk necrose, wordt uitgedrukt als het percentage infarct weefsel in het risicogebied van de linker ventrikel. Dit kan gemeten met triphenyltetrazolium kleuring 11. 2. Amygdala Isolatie Plaats het dier hoofd eerst in een kegelvormige zakje met zijn neus uitsteekt uit de nauwe eindopening. Beveiligde rat om elke beweging te vermijden. Positioneer het hoofd op de juiste wijze op de guillotine, tussen de schaar messen. Onthoofden dier. Plaats het hoofd van de rat in een schotel gehouden op crushed ijs. Voer alle procedures weefsel isolatie op gemalen ijs (4 ° C). Opengesneden skull met een schaar voorzichtig los bot scheden met been rongeurs door te trekken en het vermijden van verminken het weefsel eronder. Leg de platte kant van een spatel tussen de onderkant van de schedel en het achterste ventrale oppervlak van de hersenen en zorgvuldig losmaken hersenen van de schedel diept het blad voorwaarts langs de onderkant van de schedel tot de hersenen langzaam kan worden opgetild uit de schedel. Gooi de schedel. Plaats de hersenen op zijn dorsale oppervlak. Identificeer hypothalamus (structuur tegenover het cerebellum) en snijd de hersenen coronaalwaarts vóór het voorste uiteinde en achter het achterste uiteinde; gooi de voorste en achterste delen van de hersenen als nodig voor andere doeleinden. Visualiseer de amygdalas als kleine bolletjes onder de temporale kwabben, bilateraal, net naast de hypothalamus. Flip de hersenen plat op de voorste einde, dorsale oppervlak weg van de experimentator. Beginnen met de linker of rechterkant van de hersenen. Scheid de hemibollen en dan de cortex van de aangrenzende amygdala. Snijd weg ongeveer 8 mm van deze losse cortex aan de isolatie van de amygdala mogelijk te maken. Weggesneden amygdala met scalpel. Isoleer de basolaterale deel van de amygdala van zijn centromedial deel door te snijden langs het donker hechtdraad dat over het loopt, bijna de helft en de helft. Deze structuur is niet altijd gemakkelijk te identificeren. Zet amygdala subparts in afzonderlijke geïdentificeerd flesjes en blijf op crushed ijs. Herhaal dissectie procedure bij de andere hersenhelft. Dompel ampullen in vloeibare stikstof gedurende 1 minuut. Houd flacon in -80 ° C vriezer totdat het nodig is. 3. Caspase-3 Activity Bereid lysis buffer met 0,32 M sucrose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur, 2 mM dithiothreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 ug / ul leupeptine , 10 ug / ul pepstatine A en 10 ug / ul van aprotinine. Voeg 150 ul lysisbuffer aan elk monster (5-10 mg). Houden op het ijs. Ultrasone trillingen elk monster op ijs gedurende 5 sec bij maximale intensiteit (40 W). Incubeer weefsel in lysis buffer op ijs gedurende 30 min. Vortex elk monster gedurende 5 min. Voer 3 vries / ontdooi cycli door het plaatsen van monsters in vloeibare stikstof afwisselend en een thermostatisch geregelde verwarmingsplaat ingesteld op 37 ° C. Centrifuge weefsel bij 13.000 g (4 ° C) gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig supernatant en in buis te houden op het ijs. Bereid standaard eiwitconcentraties tussen 0 en 10 ug / ml met runderserumalbumine. Bereid blanks met slechts buffer. Voeg 200 ul van Bradford-reagens aan elke standaard. Lees standaard bij 595 nm. Voor eiwitniveaus, voeg 5 ul monster supernatant aan 795 pl gedestilleerd water en 200 pl Bradford-reagens. Lees elk monster bij 595 nm en gekwantificeerd eiwit met standaardcurve. Bereid reactiebuffer met 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl 2 </ sub>, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur, 0,1% van 3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat en 1 mM dithiothreitol. Voeg 25 ug eiwit reactiebuffer en caspase-3 substraten positieve en negatieve reactieve monsters. Voor negatieve monsters, voeg reactiebuffer, 25 ug eiwit, 0,4 gl Ac-DEVD-CHO 800 pM en 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Voor positieve monsters, voeg 25 ug eiwit reactiebuffer en 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Verwerken alle negatieve en positieve monsters in drievoud. Vul het eindvolume van elk monster tot 200 ul door toevoegen reactiebuffer. Opbrengst negatieve controles door toevoeging van 188,7 pl reactiebuffer tot 0,5 gl Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 gl Ac-DEVD-AMC 10 mM en 10 pl lysisbuffer. Voor positieve controles, voeg 189,2 pi reactiebuffer, 0,8 pi van Ac-DEVD-AMC 10 mM en 10 pl lysisbuffer. Incubeer monsters encontroles in het donker gedurende 3 uur bij 37 oC Stop de reactie met 600 ul 0,4 M glycine en 0,4 M NaOH (pH 10) in elk monster en controle. Kwantificeren fluorescentie door spectrofluorimetrie bij excitatie golflengte van 365 nm en emissie golflengte van 465 nm. Voeg 2 ml gedestilleerd water om de reactie in glas cuvet. Lees controles en monsters voor 10 sec met 1 punt bij elke sec. Kwantificeren specifieke activiteit in elk monster: ((Fluorescentie van negatieve monsters minus fluorescentie van positieve monsters) x volume van 2,8 ml) gedeeld door (incubatietijd 3 uur x hoeveelheid eiwit 25 mg).