Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

El protocolo contiene una descripción detallada de los pasos siguientes: En primer lugar, fantasmas o ratones y la cama ratón multimodal se preparan para la imagen. A continuación, una exploración de todo el cuerpo se adquiere en el μCT. Posteriormente la cama ratón se transfiere a la FMT donde dos exploraciones se adquieren (y al revés). Esto se puede repetir para múltiples ratones en múltiples puntos de tiempo. Después de la finalización de la adquisición de datos, los datos deben ser exportados y ordenados para permitir la segmentación automatizada (que requiere una licencia de software Definiens), así como la fusión de imágenes y reconstrucción de fluorescencia (que requiere una licencia de software Imalytics preclínica). Finalmente se muestra cómo los conjuntos de datos multimodales se visualizan y cómo órganos están segmentados de forma interactiva para cuantificar la biodistribución de sondas fluorescentes. 1. Preparación Phantom NOTA: Phantoms son útiles para probar el sistema de formación de imágenes, sino también para determinar la calibración de factor para una nueva sonda. Preparar una solución de agua de 200 ml, 2% de agarosa, 1,8 g de polvo de TiO2, 50 l de azul de tripano. Después de hervir, llenar la solución en una forma rectangular, aproximadamente de 8 cm de longitud, 3 cm de ancho, y 1,5 cm de altura. Prepare varias inclusiones fluorescentes en el espectro utilizando puntas de pipeta, que contiene una mezcla de fluorescencia y de contraste μCT. Para crear las inclusiones, cortar las puntas de pipeta y sellarlos con un encendedor. Después la solución se ha solidificado, inserte las inclusiones en el fantasma. Cortar algunas partes del espectro para lograr una forma irregular y para adaptarse a la titular del ratón multimodal. Para determinar el factor de calibración para una nueva sonda, se requieren algunas exploraciones fantasma. Para ello, el FMT fantasma predeterminado se utiliza en combinación con cantidades conocidas de la sonda. Para una mayor precisión, añadir 4% de emulsión de lípidos a la solución para recibir el mismo coeficiente de dispersión dentro de la inclusión como en elresto del fantasma. También agregue una pequeña cantidad (2%) de agente de contraste μCT para el análisis de imágenes más fácil. 2. Preparación del ratón NOTA: imágenes μCT-FMT requiere una preparación especial, incluyendo anestesia y la depilación. Coloque el ratón sobre la comida-clorofila libre 7 días antes de la imagen. Esto reducirá la señal de fondo y es particularmente importante para los canales por debajo de 750 nm FMT. Todos los experimentos con animales se realizan bajo anestesia. Para iniciar la anestesia, coloque el ratón en una cámara llena de 2% de isoflurano en el aire (caudal de 5 l / min) hasta que el ratón se está quedando dormido. Confirmar anestesia adecuada por los pies suaves o pellizcar la piel y comprobando la relajación del tono muscular (por ejemplo., Músculo de la mandíbula). Para mantener la anestesia, continuar la aplicación isoflurano usando un tubo que se coloca en la nariz del ratón (2% de isoflurano en el aire, caudal 1 L / min). A fin de evitar drynes ojos, utilice ungüento veterinario en ratones anestesiados. Para inyectar medio de contraste, fijar el ratón anestesiado sobre una almohadilla térmica con cinta. Colocar un (aguja de la jeringa unida a un tubo) catéter a la vena de la cola e inyectar el agente de contraste fluorescente (por ejemplo, 2 nmol, con un volumen máximo de inyección de 5 ml / kg de peso corporal, es decir, 150 l para una 30 g de ratón). Para escanear un ratón peludo, el área de exploración tiene que depilar con antelación. Para ello, utiliza una crema de eliminación de la máquina de afeitar o el cabello. Algunas cepas de ratones pueden desarrollar erupciones de la crema de depilación. Por lo tanto, controlar los ratones para cambios en la piel y en contacto con el personal veterinario para la atención si es necesario. También prueba la tolerancia en un pequeño número de animales al usar nuevas cepas de ratón. Mantenga el ratón anestesiado durante μCT y FMT de formación de imágenes (2% de isoflurano en el aire, caudal 1 L / min). 3. Ratón Cama Preparación NOTA: Para el escaneado μCT-FMT, use un multimodalcama de ratón, que se ajusta tanto a la μCT y la FMT. Antes de imagen, limpiar la cama ratón con toallitas húmedas. No utilice el etanol, ya que puede dañar el vidrio acrílico. Asegúrese de que los marcadores están libres de agua, ya que esto puede afectar a la detección de marcadores automatizado. Abrir los tornillos de la cama del ratón multimodal y quitar la parte superior. Conecte el tubo de gas anestésico en la cama del ratón y fijar con cinta. Coloca el ratón anestesiado en el lecho del ratón y poner la nariz en el tubo de gas. Asegúrese de que la cabeza del ratón es el indicador delante de la cama del ratón (Figura 1). Asegúrese de que el ratón está en el centro de la cama ratón para utilizar de manera óptima el campo de visión de la FMT. Cierre la cama ratón y apriete los tornillos hasta que el ratón se mantiene con fuerza. Asegúrese de que el ratón puede respirar de manera constante por el control visual de los movimientos respiratorios torácicos. 4. μCT Imaging NOTA: Una exploración de todo el cuerpo se realiza utilizando el μCT. Se requiere que el anatómica de datos generado para la fusión de imágenes, para una mejor reconstrucción de fluorescencia y para el análisis de imagen. Coloque la cama del ratón con el ratón en la μCT. Asegúrese de que el ratón se coloca de una manera que va "cola-primero" en el μCT. Esto es importante para la fusión automatizado. A fin de mantener la anestesia cuando el μCT-tapa está cerrada, vuelva a conectar los tubos para canalizar el gas a través del caso de la μCT. En primer lugar separar el tubo largo del lecho del ratón y adjuntarlo al conector en la parte exterior de la μCT. A continuación, conecte el extremo libre que queda en el conector dentro del μCT. Conduzca la cama del ratón en el μCT. Asegúrese de que el tubo de gas no está suelto y no puede quedar atrapado por el pórtico rotativo. Si es necesario, fijar con cinta. Inserte el tubo en el recorte de la titular de la cama del ratón. </li> Cierre la μCT y adquirir un topograma. Seleccione al menos dos subscans para cubrir una parte sustancial del ratón y la cama de ratón, que es importante para la fusión y la reconstrucción. Seleccione el protocolo de exploración μCT llamado HQD-6565-360-90, que adquiere 720 proyecciones con 1032 x 1012 píxeles en una rotación completa que requiere un tiempo de exploración de 90 s por subexploración. Los tubos se operaron a tensión de 65 kV y corriente de 1,0 mA. Alternativamente, para reducir la dosis de radiación y el escaneo duración, seleccione el protocolo de exploración SQD-6565-360-29 que adquiere 720 proyecciones con 516 x 506 píxeles con tiempo de exploración 29 s por subexploración. Inicie el escaneo μCT. La barra azul indica el progreso. Los subscans serán adquiridas posteriormente. La hipotermia y la pérdida de fluido no son un problema debido a la corta duración de exploración de sólo unos pocos minutos. No abra la tapa de la μCT durante la exploración, ya que esto interrumpa automáticamente el escaneo para proteger al usuario deradiación. Cuando el análisis haya finalizado, abra la tapa, vuelva a conectar el tubo de anestesia y separar la cama de ratón del soporte para transportar a la FMT. 5. FMT Imaging NOTA: Directamente después de la digitalización μCT, el ratón se escanea en el FMT en dos configuraciones (arriba y boca abajo) que se utilizan juntos por una mejor reconstrucción de fluorescencia. Abra el suministro de gas anestésico (2% de isoflurano en el aire, caudal de 1 l / min) para la FMT antes de colocar la cama ratón en la FMT. Utilizando el software de control de FMT, crear un grupo de estudio con un número adecuado de sujetos (es decir, los ratones). Seleccione las sondas que se utilizarán para la imagen (uso OsteoSense de nuevas sondas que no figuran). Llevar a la cama del ratón multimodal con el ratón a la FMT. El tubo de gas anestésico largo y flexible mantiene el flujo de gas. Antes de insertar la cama ratón en la FMT, retire con cuidado el tubo ya queNo se necesita dentro de la FMT. Evite girar los tornillos de la cama del ratón. Coloque la cama ratón en la FMT con el indicador rojo primero ("cabeza-primero"). Esto es importante para la fusión de imágenes para ser coherente con la μCT. Cierre la FMT. Seleccione el grupo de estudio correctos y tema. Seleccione el canal deseado de la FMT (por OsteoSense 750EX, utilice el canal de 750 nm). Añadir una descripción, por ejemplo., "Arriba" o "abajo" y adquirir una visión general de exploración pulsando "captura". Esta captura una imagen de reflectancia de todo el campo de visión. Asegúrese de no tener "Sólo reflectancia Imágenes" seleccionados, porque de lo contrario no es posible adquirir 3D escanea posteriormente. Ajuste los parámetros de imagen para el escaneo 3D. Ampliar el campo de visión para incluir lo más posible del ratón. Por lo general, la cabeza y la cola no caben por completo en el campo de visión, sin embargo. Haga clic en "Opciones avanzadas221; y comprobar los ajustes de imagen. Establecer densidad de muestreo a 3 mm, la sensibilidad a la normalidad y la iluminación min / max a 5.000 y 50.000, respectivamente. Haga clic en "añadir a la cola de la reconstrucción" y luego haga clic en "Scan" para iniciar la exploración FMT. Esto tomará alrededor de 5 a 15 min, dependiendo del tamaño y el grosor del ratón, ya que se requieren tiempos de exposición más largos para los objetos más gruesos. El dispositivo contiene una cámara de imágenes climatizada para evitar la hipotermia. Después de la exploración, dar la vuelta a la cama del ratón incluyendo el ratón boca abajo y adquirir otra exploración. Esto proporciona datos adicionales para la reconstrucción de fluorescencia. Cuando el μCT y los FMT-scan se han completado y el ratón se despierta de la anestesia, no lo deje sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente, por ejemplo, caminar alrededor o para mantener decúbito esternal. 6. Imagen de Fusión y Reconstrucción NOTA: Despuésla finalización de la exploración μCT-FMT, por ejemplo, al final del estudio, los datos adquiridos tiene que ser resuelto para permitir la fusión de imágenes automatizado y la reconstrucción de fluorescencia. Para ordenar las exploraciones para su posterior procesamiento, cree una carpeta para el estudio. Para cada exploración μCT-FMT, cree una subcarpeta cuyo nombre contiene el ID del ratón y el punto de tiempo, por ejemplo., M01_02h. Para escanear cada μCT-FMT, exportar los escaneos FMT (arriba y abajo) como .fmt archivos y guardarlos en la subcarpeta utilizando nombres de archivos que terminan con cualquiera "_up.fmt" o "_down.fmt". Cada archivo .fmt contiene los datos en bruto adquiridos, es decir, las imágenes de excitación y emisión adquiridos por la cámara, los metadatos, tales como los tiempos de exposición, y la reconstrucción de fluorescencia generada por la FMT. Usando el software μCT, crear una reconstrucción con el tamaño de vóxel isotrópico 35 micras. Seleccionar un kernel de reconstrucción suave (T10). Ajuste el campo de visión de modoque todo el lecho de ratón incluyendo los marcadores está cubierto. Seleccione MIFX / RAW como formato de salida y comenzar la reconstrucción. Después de la reconstrucción se hace, mover los archivos de reconstrucción μCT en la subcarpeta de la exploración μCT-FMT. Exportar los datos μCT y FMT para todos los escaneos. Asegúrese de que cada subcarpeta contiene dos archivos .fmt (arriba y abajo) y la reconstrucción μCT en el formato MIFX / RAW. Para comprobar la integridad seleccionar Menú-> CT-FMT-> comprobación de la integridad utilizando el software Imalytics preclínicos. Puede aparecer una lista de errores, tales como falta .fmt archivos o reconstrucciones μCT. Corregir los errores y compruebe si hay integridad hasta que se resuelvan todos los errores. Usando Menú-> Configuración CT-FMT->, compruebe el nombre del servidor del software Definiens y ajustar si es necesario. El valor predeterminado es http: // localhost: 8184, en el supuesto de que el software Definiens está instalado en el mismo equipo. El software Definiens se requiere en el siguiente paso para realizar la ausegmentación tomatizada de la cama del ratón y marcadores. Haga clic en Menú-> CT-FMT-> Grupo de fusibles en el software Imalytics preclínicos para llevar a cabo la fusión automatizado μCT-FMT durante todo el estudio. Esto toma unos minutos por μCT-FMT escanear y resulta en una carpeta con el sufijo "paquete" paralela a la carpeta de estudio. Este contiene un subconjunto más pequeño de archivos (los datos μCT y la FMT reconstrucción proporcionado por el proveedor fusionado) que son relevantes para su posterior análisis. Haga clic en Menú-> CT-FMT-> Reconstruir grupo (FMT) en el software Imalytics preclínicos para llevar a cabo la reconstrucción de fluorescencia incluyendo la generación de absorción y dispersión de mapas 13. A pesar de que el procesamiento es acelerado por la GPU 20, cada reconstrucción requiere de 1 a 4 horas dependiendo del tamaño del ratón. Los resultados se almacenan en la carpeta del paquete. Nota: Para permitir un mayor rendimiento, actualmente realizamos estas reconstrucciones en un clúster de GPU con 56 GPUs. </li> Análisis 7. Imagen NOTA: Para extraer mediciones cuantitativas de los datos de imagen, es necesaria la segmentación de las lesiones y órganos. Una vez que todos los conjuntos de datos se fusionan y reconstruidos, crean una segmentación para cada μCT-FMT escanear utilizando el software Imalytics preclínicos. Cargar un archivo μCT como capa base y el archivo de fluorescencia como superposición. Pulse el botón "3D" para encender la representación de volumen e inspeccione el conjunto de datos. Para segmentar el pulmón, haga clic en Menú-> Classes-> Agregar clase y crear una clase llamada "tmp". Esto también puede hacerse a través del menú de contexto. La creación de una nueva clase define automáticamente como clase de salida para las operaciones de segmentación posteriores. Realizar una operación de umbralización segmentar todas las regiones con baja intensidad en el conjunto de datos μCT (clic Menú-> Segmentation-> Thresholding-> Abajo e introduzca 600). Ahora la clase tmp contiene el aire fuera de la moutilizar, sino también el tejido pulmonar. Crear una clase de "pulmón". Realice una operación "Fill Región" (botón derecho del ratón en el pulmón y seleccione Menú-> Rellenar Región-> Rellenar región ilimitado), para separar el pulmón del aire exterior. Eliminar la clase tmp ya que no se necesita más. Para regiones convexas segmento, por ejemplo., La vejiga, utilice el modo de garabato. En primer lugar crear una "vejiga" clase. Pulse F1 para borrar todos los garabatos. Utilizando el ratón del ordenador, dibujar garabatos para delinear los límites de la vejiga. Presione F3 para llenar la región encerrada por los garabatos con una máscara temporal que aparece como superposición de rojo. Añadir iterativamente más garabatos (en cualquier orientación slicing) y presione F3 hasta que se consigue una exactitud suficiente. Típicamente, garabatos en 10 rebanadas son suficientes. Presione F4 para guardar la máscara temporal como "vejiga". Proceda como este para el segmentootras regiones convexas tales como el corazón y los riñones. Muchas regiones, por ejemplo., El estómago o el hígado, pueden ser aproximadas por unas pocas regiones convexas. Para el segmento de la columna vertebral, en primer lugar crear una clase "hueso". Seleccionar ContextMenu-> Thresholding-> Por encima de realizar una operación de umbralización para clasificar todos los voxels brillantes (por ejemplo., Por encima de 1600) como "Bone". Una operación de llenado región dejaría de segmento de la columna vertebral, ya que está conectado con muchas otras partes del esqueleto, por ejemplo., Las costillas. Realizar unas cuantas operaciones de corte dibujando garabatos iterativa y pulsando F2 para separar la espina dorsal del cráneo, las costillas y el hueso sacro. Por último, cree una clase de "columna vertebral" y llevar a cabo una operación de llenado región para obtener la columna vertebral (botón derecho del ratón en la columna vertebral y seleccione ContextMenu-> Rellenar Región-> Rellenar región ilimitado). Guarde la segmentación como un archivo dentro ªe subcarpeta de la exploración μCT-FMT. Utilice un nombre consistente, por ejemplo, organs.seg, para permitir que el procesamiento por lotes. Seleccione Menú-> Statistics-> Clase estadísticas (overlay), para generar una hoja de cálculo que contiene la intensidad de fluorescencia media, el volumen y la cantidad total (producto de la media y volumen) para cada clase. Para generar una sola hoja de cálculo que contiene los valores para todas las regiones de todos los análisis μCT-FMT, haga clic en Menú->> Configuración por lotes Conjunto lotes y haga clic en Menú-> por lotes> estadísticas por lotes. Esto evita el esfuerzo de creación y combinación de muchos archivos de hojas de cálculo, es decir, uno para cada exploración μCT-FMT. 8. Sonda de calibración Para calcular el factor de calibración para una sonda, múltiples exploraciones fantasma μCT-FMT con se requieren diferentes cantidades conocidas de la sonda (véase el paso 1.4), por ejemplo., Con 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol y 0 pmol. Analiza los fantasmas como se describe enSe requieren las secciones 4 y 5. También para exploraciones fantasmas, arriba y abajo en las exploraciones del FMT. Exportar los datos y llevar a cabo la fusión y la reconstrucción como se describe en la sección 6. Segmento de la inclusión mediante los datos μCT para cada exploración por umbralización (por encima de 1200) y el llenado región. Generar una hoja de cálculo con las cantidades de fluorescencia medidos y colócalas en función de las cantidades conocidas. Calcular la pendiente de un ajuste de regresión lineal. Este es el factor de calibración para la sonda.