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Bioengineering

Hybrid Imaging μCT-FMT e analisi delle immagini

Published: June 04, 2015
doi:
10.3791/52770
, , , , , , ,
1Experimental Molecular Imaging,RWTH Aachen University, 2Institute for Biomedical Engineering – Biointerface Laboratory,RWTH Aachen University, 3Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences,Utrecht University

Summary

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Abstract

Fluorescenza-mediata tomografia (FMT) consente la determinazione longitudinale e quantitativa della distribuzione della fluorescenza in vivo e può essere utilizzato per valutare la biodistribuzione di nuove sonde e di valutare la progressione della malattia utilizzando sonde molecolari stabiliti o geni reporter. L'abbinamento con una modalità anatomica, ad esempio, micro tomografia computerizzata (μCT), è utile per l'analisi delle immagini e per la ricostruzione di fluorescenza. Descriviamo un protocollo per l'imaging multimodale μCT-FMT comprese le fasi di elaborazione delle immagini necessarie per estrarre misure quantitative. Dopo aver preparato i topi e l'esecuzione della immagini, i set di dati multimodali sono registrate. Successivamente, viene eseguita una migliore ricostruzione fluorescenza, che tiene conto della forma del mouse. Per l'analisi quantitativa, segmentazioni organi vengono generati in base ai dati anatomici utilizzando il nostro strumento di segmentazione interattivo. Infine, il cu biodistribuzionerves vengono generati utilizzando una funzione di elaborazione batch. Noi mostriamo la applicabilità del metodo valutando la biodistribuzione di una sonda noto che si lega alle ossa e articolazioni.

Introduction

Tomografia fluorescenza-mediata, tomografia molecolare chiamato anche a fluorescenza (FMT), è una tecnica promettente per valutare quantitativamente la distribuzione di fluorescenza nei tessuti diffuse, come i topi anestetizzati o addirittura tessuti del corpo umano, ad esempio, il seno o alle articolazioni delle dita. Contrariamente alle tecniche di microscopia non invasive, che permettono l'imaging di bersagli superficiali con risoluzione subcellulare 1, FMT permette la ricostruzione tridimensionale di sorgenti fluorescenti in profondità di diversi centimetri, anche se a bassa risoluzione 2. Molti sonde fluorescenti mirate sono a disposizione per l'angiogenesi immagine, l'apoptosi, infiammazione, e altri 2-5. Alcune sonde sono attivabili, ad es., Da specifici scissione enzimatica che porta alla unquenching di fluorocromi. Inoltre, geni reporter che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere esposte, ad esempio, per monitorare la migrazione delle cellule tumorali 6.

FMT beneficia fortemente dalla combinazione con una modalità anatomica, ad esempio, μCT 2,7 o RM 8. Mentre i dispositivi FMT autonomi sono commercialmente disponibili 9, le immagini a fluorescenza sono difficili da interpretare senza informazioni di riferimento anatomici. Recentemente siamo stati in grado di dimostrare, che i dati fuso immagine anatomica permette una più robusta analisi 10. I dati anatomici possono anche essere utilizzati per fornire conoscenza precedente, come ad esempio la forma esterna del mouse, che è importante per la modellazione ottica accurata e fluorescenza ricostruzione 11. Inoltre, di scattering e di assorbimento mappe ottici possono essere stimate utilizzando la segmentazione dei tipi di tessuti e assegnando classe coefficienti specifici 12,13. Per la luce nel vicino infrarosso, l'emoglobina è l'assorbitore principale nei topi, oltre melanina e pelliccia 14. Poiché il volume di sangue relativa varia regionalmente di ordini di grandezza, una mappa assorbimento è particolarmente importante per quanquantita- fluorescenza ricostruzione 13.

Un vantaggio di utilizzare dispositivi di imaging non invasive è che i topi possono essere esposte in senso longitudinale, cioè, in più punti di tempo. Questo è importante per valutare il comportamento dinamico di sonde, cioè, il loro accumulo di destinazione, la biodistribuzione e l'escrezione 10,15, oppure per valutare la progressione della malattia 16. Quando l'imaging diversi topi a vari intervalli di tempo, una grande quantità di set di dati di immagine deriva. Per consentire la comparabilità, questi devono essere acquisiti in modo sistematico, cioè con un protocollo ben definito e documentato. Il gran numero di scansioni rappresenta una sfida per l'analisi delle immagini, che è necessaria per estrarre misure quantitative dei dati di immagine.

Lo scopo del nostro studio è quello di fornire una descrizione dettagliata di un protocollo di imaging μCT-FMT che abbiamo usato e ottimizzato tutto diversi studi 10,13,15,17,18. Descriviamocome vengono generati i set di dati, elaborati, visualizzati e analizzati. Questo è dimostrato utilizzando una sonda molecolare consolidata, OsteoSense, che si lega ad idrossiapatite 19, e può essere utilizzato per le malattie delle ossa e il rimodellamento immagine 2. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal comitato di revisione governativo sulla cura degli animali.

Protocol

Il protocollo contiene una descrizione dettagliata dei seguenti passaggi: Dapprima, fantasmi o topi e il letto multimodale del mouse sono preparati per l'imaging. Poi una scansione di tutto il corpo è acquisito nel μCT. Successivamente il letto mouse viene trasferito al FMT dove due scansioni vengono acquisiti (e capovolto). Questo può essere ripetuto per più topi a vari intervalli di tempo. Dopo il completamento dell'acquisizione di dati, i dati devono essere esportati e ordinati per abilitare la segmentazione automatica (che richiedono una licenza software Definiens), così come l'immagine di fusione e la ricostruzione di fluorescenza (che richiedono una licenza software Imalytics preclinici). Infine si mostra come le serie di dati multimodali sono visualizzate e come organi sono segmentati in modo interattivo per quantificare la biodistribuzione di sonde fluorescenti. 1. Phantom Preparazione NOTA: Phantoms sono utili per testare il sistema di imaging, ma anche per determinare la calibrazione factor per una nuova sonda. Preparare una soluzione di acqua da 200 ml, 2% agarosio, 1,8 g TiO2 in polvere, 50 pl trypan blu. Dopo la bollitura, riempire la soluzione in una forma rettangolare di circa 8 cm di lunghezza, 3 cm di larghezza e 1,5 cm di altezza. Preparare diverse inclusioni fluorescenti nel fantoccio con puntali per pipette, che contiene un mix di fluorescenza e mezzo di contrasto μCT. Per creare le inclusioni, tagliare le punte per pipette e chiuderli con un accendino. Dopo che la soluzione è solidificato, inserire le inclusioni nella phantom. Tagliare alcune parti del fantoccio per ottenere una forma irregolare e per adattarsi al supporto per mouse multimodale. Per determinare il fattore di calibrazione per una nuova sonda, sono necessarie alcune scansioni fantasma. Per questo, il default FMT phantom è usato in combinazione con quantità note della sonda. Per una maggiore precisione, aggiungere 4% emulsione lipidica alla soluzione per ricevere lo stesso coefficiente di scattering dentro l'inclusione nelresto del fantasma. Anche aggiungere una piccola quantità (2%) di mezzo di contrasto μCT per facilitare l'analisi delle immagini. 2. Preparazione del mouse NOTA: l'imaging μCT-FMT richiede una preparazione speciale anche anestesia e depilazione. Posizionare il mouse su alimenti privi di clorofilla 7 giorni prima di imaging. Questo ridurrà il segnale di fondo ed è particolarmente importante per i canali FMT inferiori ai 750 nm. Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in anestesia. Per avviare la anestesia, posizionare il mouse in una camera riempita con 2% isoflurano in aria (portata 5 l / min) fino a quando il mouse si sta addormentando. Verificare il corretto anestesia da punta dolce o la pelle pizzicare e controllando rilassamento del tono muscolare (ad es., La mascella muscolare). Per sostenere l'anestesia, continuare l'applicazione isoflurano utilizzando un tubo che viene inserito sul naso del mouse (2% isoflurano in aria, portata 1 L / min). Per evitare drynes occhios, uso veterinario pomata sui topi anestetizzati. Per iniettare mezzo di contrasto, correggere il mouse anestetizzato su una piastra elettrica con del nastro. Inserire un (ago siringa collegata ad un tubo) catetere per la vena della coda e iniettare il mezzo di contrasto fluorescenti (ad esempio, 2 nmol, con volume massimo di iniezione di 5 ml / kg di peso corporeo, cioè, 150 ml per 30 g mouse). Per la scansione di un topo peloso, l'area di scansione deve essere depilato in anticipo. Per questo, utilizzare una rimozione del rasoio o capelli crema. Alcuni ceppi di topi possono sviluppare eruzioni cutanee dalla crema depilatoria. Pertanto, monitorare i topi per le modifiche della pelle e contattare il personale veterinario per le cure in caso di necessità. Verificare anche la tolleranza su un piccolo numero di animali utilizzando nuovi ceppi di topi. Tenete il mouse anestetizzato durante μCT e FMT immagini (2% isoflurano in aria, portata 1 L / min). 3. Letto mouse Preparazione NOTA: Per la scansione μCT-FMT, utilizzare un multimodaleLetto mouse, che si adatta sia in μCT e FMT. Prima di imaging, pulire il letto del mouse con i tessuti bagnati. Non usare l'etanolo, perché questo potrebbe danneggiare il vetro acrilico. Assicurarsi che i marcatori sono privi di acqua, perché ciò può mettere in pericolo il rilevamento automatico di marcatore. Aprire le viti del letto multimodale mouse e rimuovere la parte superiore. Fissare il tubo del gas anestetico sul letto del mouse e fissare con nastro adesivo. Posizionare il mouse anestetizzato nel letto del mouse e mettere il naso nel tubo del gas. Assicurarsi che il capo del mouse è l'indicatore davanti al letto mouse (Figura 1). Assicurarsi che il mouse è nel mezzo del letto del mouse sfruttare in modo ottimale il campo di vista del FMT. Chiudere il letto del mouse e stringere le viti fino a quando il mouse è strettamente tenuto. Assicurarsi che il mouse può respirare costantemente di monitoraggio visivo dei movimenti respiratori toracici. 4. I μCTmaging NOTA: una scansione di tutto il corpo viene eseguita utilizzando il μCT. È necessario il dati anatomici generato per fusione delle immagini, per una migliore ricostruzione fluorescenza e per l'analisi delle immagini. Posizionare il letto del mouse con il mouse nella μCT. Assicurarsi che il mouse viene posizionato in modo che esso va "tail-first" nella μCT. Questo è importante per la fusione automatica. Per sostenere l'anestesia quando il μCT-coperchio è chiuso, ricollegare i tubi per convogliare il gas attraverso il caso del μCT. Prima staccare il tubo lungo dal letto del mouse e collegarlo al connettore all'esterno del μCT. Quindi collegare il restante estremità libera al connettore all'interno del μCT. Guidare il letto mouse nella μCT. Assicurarsi che il tubo del gas non è sciolto e non può farsi prendere dal gantry rotante. Se necessario, fissare con nastro. Inserire il tubo nel cut-out del titolare del letto mouse. </li> Chiudere il μCT e acquisire un topogram. Seleziona almeno due subscans a coprire una parte sostanziale del mouse e il letto del mouse, che è importante per la fusione e la ricostruzione. Selezionare il protocollo di scansione μCT chiamato HQD-6565-360-90, che acquisisce 720 proiezioni con 1032 x 1012 pixel durante una rotazione completa che richiede un tempo di scansione di 90 s per subscan. I tubi vengono fatti funzionare con tensione di 65 kV e corrente 1,0 mA. In alternativa, per ridurre la durata dose di radiazioni e la scansione, selezionare il protocollo di scansione SQD-6565-360-29 che acquista 720 proiezioni con 516 x 506 pixel con tempi di scansione di 29 s per subscan. Avviare la scansione μCT. La barra blu indica lo stato di avanzamento. Le subscans saranno acquisiti successivamente. Ipotermia e perdita di fluido non sono un problema a causa della breve durata di scansione di pochi minuti. Non aprire il coperchio del μCT durante la scansione perché questo interromperà automaticamente la scansione per proteggere l'utente daradiazioni. Quando la scansione è completata, aprire il coperchio, ricollegare il tubo anestetico e staccare il letto del mouse dal supporto per il trasporto alla FMT. 5. FMT Imaging NOTA: Subito dopo la scansione μCT, il mouse viene analizzato nella FMT in due configurazioni (su e testa in giù) che vengono utilizzati insieme per una migliore ricostruzione fluorescenza. Accendere l'alimentazione del gas anestetico (2% isoflurano in aria, portata 1 L / min) per la FMT prima di posizionare il letto mouse nella FMT. Utilizzando il software di controllo FMT, creare un gruppo di studio con un numero adeguato di soggetti (ad esempio, i topi). Selezionare le sonde che saranno utilizzati per l'imaging (uso OsteoSense per nuove sonde che non sono elencati). Portare il letto multimodale mouse con il mouse alla FMT. Il tubo di gas anestetico lungo flessibile mantiene il flusso di gas. Prima di inserire il letto mouse nella FMT, rimuovere con attenzione il tubo in quantoNon è necessario all'interno del FMT. Evitare di girare le viti del letto del mouse. Posizionare il letto del mouse nella FMT con l'indicatore rosso prima ("head-first"). Questo è importante per la fusione dell'immagine per essere coerente con la μCT. Chiudere il FMT. Selezionare il gruppo di studio corretto e soggetto. Selezionare il canale desiderato del FMT (per OsteoSense 750EX, utilizzare il canale 750 nm). Aggiungere una descrizione, ad es., "Up" o "down" e acquisire una scansione panoramica con il tasto "Cattura". Questa cattura un'immagine riflessione di tutto il campo visivo. Assicurarsi di non avere "riflettanza Immagini Only" scelti, perché altrimenti non è possibile acquisire scansioni 3D in seguito. Regolare i parametri di imaging per la scansione 3D. Allargare il campo di vista per includere il più possibile del mouse. Di solito, la testa e la coda non del tutto adatta nel campo di vista, tuttavia. Fare clic su "Advanced221; e controllare le impostazioni di imaging. Impostare densità di campionamento a 3 mm, sensibilità alla normalità e illuminazione min / max a 5000 e 50000, rispettivamente. Fai clic su "aggiungi alla coda di ricostruzione" e poi cliccare su "Scan" per avviare la scansione FMT. Questo richiederà circa 5 a 15 minuti, a seconda delle dimensioni e dello spessore del mouse, perché i tempi di esposizione più lunghi sono necessari per gli oggetti più spessi. Il dispositivo contiene una camera di imaging riscaldata per evitare l'ipotermia. Dopo la scansione, capovolgere il letto del mouse tra cui il mouse capovolto e acquisire un'altra scansione. Ciò fornisce dati aggiuntivi relativi ricostruzione fluorescenza. Quando il μCT ei FMT scansioni sono stati completati e il topo si sveglia dall'anestesia, non lasciarlo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente, ad esempio, andare in giro o per mantenere decubito sternale. 6. Immagine Fusion e la ricostruzione NOTA: Dopocompletamento della scansione μCT-FMT, ad esempio, alla fine dello studio, i dati acquisiti deve essere risolto per consentire la fusione automatica delle immagini e ricostruzione fluorescenza. Per ordinare le scansioni per ulteriori elaborazioni, creare una cartella per lo studio. Per ogni scansione μCT-FMT, creare una sottocartella il cui nome contiene l'ID del mouse e il punto di tempo, per esempio., M01_02h. Per eseguire la scansione di ogni μCT-FMT, esportare le scansioni FMT (su e giù) come .fmt file e salvarli nella sottocartella utilizzando nomi di file che terminano con uno "_up.fmt" o "_down.fmt". Ogni file .fmt contiene i dati grezzi acquisiti, vale a dire, le immagini di eccitazione ed emissione acquisiti dalla fotocamera, i metadati, come ad esempio i tempi di esposizione, e la ricostruzione di fluorescenza generata dal FMT. Utilizzando il software μCT, creare una ricostruzione di dimensioni voxel isotropico 35 micron. Selezionare un kernel ricostruzione liscio (T10). Regolare il campo visivo cosìche l'intero letto del mouse compresi i marcatori è coperto. Selezionare MIFX / RAW come formato di output e avviare la ricostruzione. Dopo la ricostruzione è fatto, spostare i file di ricostruzione μCT nella sottocartella della scansione μCT-FMT. Esportare i dati μCT e FMT per tutte le scansioni. Assicurarsi che ogni sottocartella contiene due file .fmt (su e giù) e la ricostruzione μCT nel / formato RAW MIFX. Per verificare la completezza selezionare Menu-> CT-FMT-> Controllo della completezza utilizzando il software Imalytics preclinici. Potrebbe sembrare un elenco di errori, come ad esempio manca .fmt file o ricostruzioni μCT. Correggere gli errori e verificare la completezza finché non saranno risolti tutti gli errori. Utilizzando Menu-> Impostazioni CT-FMT->, verificare il nome del server del software Definiens e regolare, se necessario. Il valore predefinito è http: // localhost: 8184, assumendo che il software Definiens è installato sullo stesso computer. Il software Definiens è richiesto nel passo successivo per eseguire l'aula segmentazione tomated del letto del mouse e marcatori. Clicca Menu-> CT-FMT-> gruppo fusibile nel software Imalytics preclinici effettuare automatizzato fusione μCT-FMT per l'intero studio. Questa operazione richiede alcuni minuti per μCT-FMT scansione e si traduce in una cartella con il suffisso "Package" parallela alla cartella studio. Questo contiene un sottoinsieme più piccolo di file (dati μCT e FMT ricostruzione vendor-condizione fusa), che sono rilevanti per ulteriori analisi. Clicca Menu-> CT-FMT-> Ricostruire gruppo (FMT) nel software Imalytics preclinici per eseguire la ricostruzione di fluorescenza inclusa la creazione di assorbimento e dispersione mappe 13. Anche se il trattamento è accelerazione GPU 20, ogni ricostruzione richiede da 1 a 4 ore a seconda delle dimensioni del mouse. I risultati saranno memorizzati nella cartella del pacchetto. Nota: Per abilitare un throughput più elevato, al momento di eseguire queste ricostruzioni in un cluster GPU con 56 GPU. </li> Analisi 7. Immagine NOTA: Per estrarre le misurazioni quantitative dei dati di immagine, è necessaria la segmentazione delle lesioni e degli organi. Una volta che tutti i dati set sono fusi insieme e ricostruiti, creano una segmentazione per ogni μCT-FMT scansione utilizzando il software Imalytics preclinici. Caricare un file μCT come inclinazione e il file di fluorescenza come overlay. Premere il tasto "3D" per accendere il volume rendering e controllare il set di dati. Per segmentare il polmone, fare clic su Menu-> Classes-> Aggiungi classe e creare una classe denominata "tmp". Questo può anche essere fatto attraverso il menu contestuale. Creazione di una nuova classe imposta automaticamente come classe di potenza per le successive operazioni di segmentazione. Eseguire un'operazione soglia di segmentare tutte le regioni a bassa intensità nel set di dati μCT (clicca Menu-> Segmentation-> Thresholding-> Qui di seguito e immettere 600). Ora la classe tmp contiene l'aria all'esterno del mousare ma anche il tessuto polmonare. Creare una classe "Polmone". Eseguire un'operazione "Fill Regione" (tasto destro del mouse nel polmone e selezionare Menu-> Riempire Regione-> Riempire regione illimitato), per separare il polmone dall'aria esterna. Eliminare la classe tmp perché non è più necessaria. Per segmento regioni convesse, per esempio., La vescica, utilizzare la modalità scarabocchio. Innanzitutto creare una "vescica" class. Premere F1 per eliminare tutti scarabocchi. Utilizzando il mouse del computer, disegnare scarabocchi per delineare i confini della vescica. Premere F3 per riempire la regione compresa tra gli scarabocchi con maschera temporanea che appare come overlay rosso. Iterativamente aggiungere altri scarabocchi (in qualsiasi orientamento affettatrice) e premere F3 fino ad ottenere una sufficiente precisione. Tipicamente, scarabocchi in 10 fette sono sufficienti. Premere F4 per memorizzare la maschera temporanea come "vescica". Procedere in questo modo per segmentoaltre regioni convesse quali il cuore e reni. Molte regioni, ad esempio., Lo stomaco o il fegato, possono essere approssimate da alcune regioni convesse. Per segmento della colonna vertebrale, prima creare una classe "Bone". Selezionare ContextMenu-> Thresholding-> Sopra per eseguire un'operazione di soglia per classificare tutti i voxel luminose (ad es., Sopra 1.600) come "Bone". Una operazione di riempimento regione non riuscirebbe a segmento della colonna vertebrale, perché è collegato con molte altre parti dello scheletro, ad es., Le costole. Eseguire un paio di operazioni di taglio da iterativo disegnando scarabocchi e premendo F2 per separare la colonna vertebrale dal cranio, le costole, e l'osso sacro. Infine, creare una classe "Spine" e eseguire un'operazione di riempimento regione per ottenere la colonna vertebrale (tasto destro del mouse nella colonna vertebrale e selezionare ContextMenu-> Riempire Regione-> Riempire regione illimitato). Salvare la segmentazione come file all'interno the sottocartella della scansione μCT-FMT. Utilizzare un nome coerente, ad esempio, organs.seg, per consentire l'elaborazione batch. Selezionare Menu-> Statistics-> statistiche Class (overlay), per generare un foglio che contiene l'intensità di fluorescenza media, il volume e la quantità totale (prodotto di media e volume) per ogni classe. Per generare un unico foglio di lavoro contenente i valori di tutte le regioni di tutte le scansioni μCT-FMT, fare clic su Menu-> per lotti> impostazioni Impostare in batch e quindi fare clic su Menu-> per lotti> statistiche batch. Questo evita lo sforzo di creare e fondere molti fogli di calcolo, cioè, uno per ogni scansione μCT-FMT. 8. Sonda di calibrazione Per calcolare il fattore di calibrazione per una sonda, più scansioni fantasma μCT-FMT con sono necessarie diverse quantità note di sonda (vedi punto 1.4), ad es., Con 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol e 0 pmol. Scansione i fantasmi, come descritto nellaSezioni 4 e 5. Inoltre per le scansioni fantasma, su e giù per le scansioni in FMT sono obbligatori. Esportare i dati ed eseguire la fusione e la ricostruzione, come descritto nella sezione 6. Segmento l'inserimento utilizzando i dati μCT per ogni scansione da thresholding (sopra 1.200) e riempimento regione. Genera un foglio di calcolo con i valori di fluorescenza misurati e tracciarli in funzione delle quantità note. Calcolare la pendenza di una forma di regressione lineare. Questo è il fattore di calibrazione della sonda.

Representative Results

Abbiamo applicato il protocollo descritto per valutare la biodistribuzione di una sonda mirata, OsteoSense, che si lega alla idrossiapatite. 3 topi (C57BL / 6 ApoE – / – / – AHSG – doppia topi knockout, 10 settimane) sono stati ripresi prima e 15 minuti, 2 ore, 4 ore, 6 ore, e 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di 2 nmol OsteoSense. Il nostro software rilevata automaticamente i marcatori costruito nel letto del mouse multimodale (Figura 1, Figura 2A, B), che ha permesso la fusione dei dati μCT anatomici con la ricostruzione della fluorescenza effettuata dal FMT (Figura 2C, D). Poiché OsteoSense è una sonda con un basso peso molecolare, un escrezione renale veloce e quindi segnale alto nella vescica urinaria è previsto. Fusione della ricostruzione fluorescenza della FMT rivelato problemi come segnale smarrito fuori della vescica (Figura 2C, D). Questi problemi si verificano perché il FMT non conosce la vera forma del mouse e assume una forma di blocco. Our ricostruzione determina la forma precisa dai dati μCT e genera dispersione e assorbimento mappe 13 al fine di consentire una più accurata ricostruzione fluorescenza con migliore localizzazione del segnale, che è particolarmente evidente per la vescica (Figura 2E, F). Per assegnare la fluorescenza ricostruito a regioni appropriate, abbiamo segmentato in modo interattivo diversi organi che utilizzano il nostro software (Figura 3). Per ciascuna delle 18 scansioni, 7 regioni sono state segmentate basate sui dati μCT, vale a dire., Cuore, polmoni, fegato, reni, colonna vertebrale, intestino e vescica. Successivamente, il software è stato utilizzato per calcolare la concentrazione di fluorescenza media per ciascuna delle regioni 126. Fortunatamente, il software fornisce una modalità batch, che calcola tutti i valori e li salva in un unico foglio di lavoro. Per visualizzare la distribuzione della fluorescenza, rendering 3D sono stati generati per ogni punto di tempo,utilizzando l'impostazione finestre paragonabile (Figura 4A-F). Utilizzando i valori di organi quantificati, la biodistribuzione è stato calcolato facendo la media dei valori di organi nel corso dei tre topi (Figura 4G). Le scansioni pre acquisite prima dell'iniezione, hanno mostrato trascurabile segnale di fondo. 15 minuti dopo l'iniezione, il segnale più forte apparso nella vescica urinaria, a causa della escrezione renale veloce. Ai successivi punti di tempo, la sonda rimanente aveva accumulato a ossa e articolazioni. Figura 1. multimodale mouse letto. (A) Il letto multimodale del mouse contiene due lastre di vetro acrilico che tengono saldamente il mouse. L'inasprimento viene regolato con due viti. Il letto del mouse contiene marcatori (fori vuoto) per la fusione di immagini. Gas anestetico viene fornito con un tubo flessibile che viene fissata con tape. (B) Il letto del mouse è fissato ad un supporto metallico e tenuto nel centro della rotazione μCT cavalletto. (C) evitare un vuoto tra il letto del mouse e il supporto del metallo, perché altrimenti, i marcatori possono essere assegnati in modo non corretto che porta alla fusione non corretta. Il tubo di gas anestetico dovrebbe essere collegato al connettore del tubo. (D) Il letto mouse deve essere inserito nel FMT con la parte anteriore prima di consentire la corretta fusione automatizzato. (E) I marcatori sono visibili alla telecamera FMT, che viene utilizzato per la rilevazione marcatore automatico e fusion. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Immagine Fusion e la ricostruzione. (A, B) Indicatori e la forma esterna del mouse sono determinati dalla algoritmo di segmentazione automatica. (C, D) 15 minuti dopo l'iniezione di OsteoSense, una notevole quantità di sonda già escreta nella vescica urinaria. Dopo la fusione la ricostruzione fornita dal produttore con i dati μCT, problemi diventano visibili. La maggior parte del segnale compare intorno alla vescica ma non all'interno della vescica e qualche segnale appare anche in aria. Ciò accade perché il FMT assume un mouse a forma di blocco. (E, F) La nostra migliore ricostruzione di fluorescenza, utilizzando la forma del mouse derivata dai dati μCT, si traduce in una migliore localizzazione della fluorescenza all'interno della vescica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Interactive Organo Segmentat. ioni (A) Per quantificare la distribuzione di fluorescenza, più organi vengono segmentati: cuore (rosso), del polmone (rosa), fegato (marrone), dello stomaco (beige), della colonna vertebrale (viola), reni (giallo), intestino (verde) , e della vescica urinaria (oro). (B) Il polmone, che è fortemente contrastata rispetto al tessuto circostante, è segmentato con soglia e riempimento regione. (C) organi rotonde, come la vescica, reni, cuore e sono segmentati utilizzando "scarabocchi". (D) Organi con una forma più complessa, ad esempio, il fegato e lo stomaco sono segmentati in modo incrementale utilizzando scarabocchi. Per segmento della colonna vertebrale, una soglia elevata è applicata a tutti i segmenti ossa. Poi alcune ossa, ad es., Le costole, sono tagliati via, fino a quando la colonna vertebrale rimane. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.entro-page = "always"> Figura 4. Biodistribuzione. Per valutare la biodistribuzione, i topi sono esplorate a diversi intervalli di tempo (AF). (A) La scansione pre, prima dell'iniezione, mostra poco segnale di fondo nel canale 750 nm. (B) 15 minuti dopo l'iniezione, una notevole quantità di sonda è già nella vescica urinaria. (C) per il punto temporale 2 h, il topo aveva urinato, che si traduce in qualche fluorescenza all'esterno del mouse. In momenti successivi (DF), il segnale appare prevalentemente le ossa e le articolazioni, vale a dire., Alla colonna vertebrale e le ginocchia. (G) La concentrazione di fluorescenza quantificata viene mostrato per organi selezionati.

Discussion

Descriviamo e applichiamo un protocollo per l'imaging multimodale μCT-FMT. Usiamo FMT disponibili in commercio e ampiamente utilizzato e dispositivi μCT 3,11,15 – 17,21. Mentre il protocollo richiede una specifica FMT, il μCT può essere sostituito da un altro μCT con funzionalità simili e parametri di scansione paragonabili, ad esempio, il campo di vista dovrebbe essere abbastanza grande per coprire il letto del mouse compresi i marcatori.

Il FMT è stato utilizzato per l'analisi biodistribuzione non combinandolo con μCT o RM 21, tuttavia, i dati anatomica è utile per aumentare la riproducibilità perché la segmentazione può essere basata sui confini di organi che sono visibili nei dati μCT 10. Mentre i dispositivi μCT-FMT integrati sono stati sviluppati 2,7, questi non sono ancora disponibili in commercio. Inoltre, l'uso di due dispositivi separati consente tubazioni, cioè., Il prossimo del mouse can essere ripreso nel μCT mentre il primo mouse è ancora in FMT, per aumentare la velocità.

Per ridurre il carico di lavoro manuale, eseguire il rilevamento automatico marcatore e fusion. Inoltre, la forma del mouse è segmentato automaticamente e questa informazione migliora significativamente il 11,13,22 ricostruzione fluorescenza. Per la ricostruzione quantitativa della fluorescenza, sono necessari assorbimento e di scattering mappe 13,23. Deriviamo la mappa di diffusione per la segmentazione automatica dei dati μCT e l'assegnazione dei coefficienti di dispersione noti di diversi tipi di tessuto (polmone, ossa, pelle, grasso, e rimanendo tessuti molli) 24. Successivamente, si ricostruisce una mappa assorbimento dai dati grezzi ottico che è particolarmente importante per gli organi ben perfusi-come il cuore e il fegato 13,20.

Scansione diversi topi a vari intervalli di tempo rapidamente traduce in un gran numero di insiemi di dati da analizzare. Per Biodisstudi buzione, diversi organi devono essere segmentato per ogni scansione μCT-FMT. Purtroppo, le segmentazioni non possono essere riutilizzati, perché il mouse viene posizionato appena nel letto del mouse ripetutamente. Usiamo uno strumento per la segmentazione interattivo, sviluppato presso il nostro istituto, tuttavia, altri strumenti potrebbero anche essere appropriato 25. Generiamo segmentazioni voxel-saggio, perché questi corrispondono meglio agli organi complessi di forme semplici quali ellissi e cubi 26. Automatizzata segmentazione intero animale sarebbe utile per ridurre ulteriormente il carico di lavoro manuale di 27, ma uno strumento di segmentazione interattivo sarebbe ancora necessaria per correggere gli errori di segmentazione. Inoltre, gli strumenti di segmentazione automatici difficilmente possono prevedere casi particolari, come le patologie correttamente. Dal momento che usiamo scansioni μCT nativi, alcuni organi come la milza sono molto difficili da segmento anche manualmente. I mezzi di contrasto avrebbero aiutato, ma ci sono problemi con la tollerabilità ed è difficile per eseguire manutenzionena distribuzione di contrasto costante durante imaging longitudinale.

Il nostro studio phantom mostra che il segnale di localizzazione è migliorata quando si utilizzano le informazioni di forma per la ricostruzione di fluorescenza. In vivo, un miglioramento simile è evidente per il punto di tempo in anticipo (15 min dopo l'iniezione), quando una grande quantità della sonda è già nel vescica urinaria. La sonda-idrossiapatite legame si accumula a ossa e articolazioni. È notevole velocità a cui ciò si verifica, cioè, il segnale è già ben visibile la colonna vertebrale 15 min dopo l'iniezione. Questo probabilmente è dovuto al basso peso molecolare della sonda, che consente stravaso veloce e diffusione delle regioni di destinazione. La sonda si lega in modo covalente alla sua idrossiapatite target e la sonda non legata viene escreto. Per i momenti successivi, tra 6 e 24 ore dopo l'iniezione, l'intensità del segnale nella spina dorsale rimane relativamente stabile, probabilmente, perché pochissima re lucedolori in profondità nel mouse per sbiancare la fluorescenza. Per il nostro studio, abbiamo utilizzato il canale 750 nm, che si traduce in background bassa fluorescenza evidente per le scansioni acquisite prima dell'iniezione. A lunghezze d'onda inferiori, più segnale di fondo si può aspettare 28.

In sintesi, si descrive un protocollo di imaging multimodale in commercio dispositivi FMT e μCT. Abbiamo dimostrato che la combinazione fornisce benefici per la ricostruzione fluorescenza. Illustriamo come le curve di biodistribuzione vengono estratti dalla grande quantità di dati di immagine mediante segmentazione organo interattivo e elaborazione batch. Noi crediamo che questo flusso di lavoro standardizzato può essere utile per lo sviluppo di farmaci e di altri studi di imaging con sonde fluorescente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Marek Weiler per l'esecuzione degli esperimenti fantasma. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (CER Starting Grant 309.495: NeoNaNo), lo Stato federale tedesco della Renania settentrionale-Vestfalia (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (FESR), ForSaTum), il tedesco Ministero dell'istruzione e della ricerca (BMBF) (programmi di finanziamento fegato virtuale (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), la RWTH Aachen University (I 3 TM Seed Fund), e della ricerca di Philips (Aachen, Germania).

Materials

FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX PerkinElmer FMT2000 Device for fluorescence molecular tomography
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo CT Imaging GmbH Tomoscope Duo Device for micro computed tomography
Multimodal Mouse Bed CT Imaging GmbH Experimental builder Partially transparent animal holder
IsoFlo (isoflurane, USP) Abbott 05260-05 Isoflurane Inhalation anesthesia
Small animal anesthesia system Harvard apparatus 726419 Complete Isoflurane Table-Top System
Chlorophyll-free mouse food Ssniff E15051 low chlorophyll / low fluorescence food
OsteoSense 750EX PerkinElmer NEV10053EX Animal FMT contrast agent
Portex Fine Bore Polythene Tubing Smith medical 800/100/120 Tube for injection catheter
Sterican 30g BBraun 4656300 Hypodermic needle for catheter
Imeron Altana pharma INLA F.1/0203/3.5337.69 CT contrast agent for the phantom inclusions
Agarose Sigma 90-12-36-6 Agarose for phantom production
TiO2 Applichem A1900,1000 Titanium oxyde as phantom scattering agent
Trypan blue Fluka 93595 Trypan blue to adjust phantom light propagation
Cy7 Lumiprobe 15020 Fluorochrome for the phantom inclusions
Lipovenoes 20% Fresenius Kabi 3094740 Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents
Definiens Developer XD Server Definiens AG Server XD Software platform for automated segmentation
Imalytics Preclinical ExMI/Gremse-IT Version 2.0.1 Software for image fusion, reconstruction and analysis
NVIDIA Geforce Titan Asus GTXTITAN6GD5 High end computer graphics card, 6GB Memory
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Gremse, F., Doleschel, D., Zafarnia, S., Babler, A., Jahnen-Dechent, W., Lammers, T., Lederle, W., Kiessling, F. Hybrid µCT-FMT imaging and image analysis. J. Vis. Exp. (100), e52770, doi:10.3791/52770 (2015).
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