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Bioengineering

Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

Published: June 04, 2015
doi:
10.3791/52770
, , , , , , ,
1Experimental Molecular Imaging,RWTH Aachen University, 2Institute for Biomedical Engineering – Biointerface Laboratory,RWTH Aachen University, 3Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences,Utrecht University

Summary

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Abstract

Fluoreszenz-vermittelte Tomographie (FMT) ermöglicht Längs- und quantitative Bestimmung der Fluoreszenzverteilung in vivo und kann verwendet werden, um die Bioverteilung von neuartigen Sonden zu bewerten und um den Krankheitsverlauf zu bewerten unter Verwendung etablierter Molekularsonden oder Reportergene werden. Die Kombination mit einer anatomischen Modalität, wie beispielsweise Mikro Computertomographie (μCT), ist vorteilhaft für die Bildanalyse und Fluoreszenz-Rekonstruktion. Wir beschreiben ein Protokoll für die multimodale μCT-FMT-Bildgebung einschließlich der Bildverarbeitungsschritte erforderlich sind, um quantitative Messungen zu extrahieren. Nach der Herstellung der Mäuse und der Durchführung der Bildgebung werden die multimodalen Datensätze registriert. Anschließend wird eine verbesserte Fluoreszenz Rekonstruktion durchgeführt, was die Berücksichtigung der Form der Maus. Für die quantitative Analyse sind Organ Segmentierungen generiert basierend auf den anatomischen Daten mit Hilfe unserer interaktiven Segmentierung Werkzeug. Schließlich wird die Bioverteilung cuRVE werden unter Verwendung eines Batch-Verarbeitungsmerkmal generiert. Wir zeigen die Anwendbarkeit des Verfahrens durch die Beurteilung der Bioverteilung von einer bekannten Sonde, die an Knochen und Gelenken bindet.

Introduction

Fluoreszenz-vermittelte Tomographie, auch als Fluoreszenzmolekular Tomographie (FMT), ist eine vielversprechende Technik für die quantitative Erfassung der Fluoreszenzverteilung in diffuse Geweben, wie narkotisierten Mäusen oder menschlichen Körpergeweben, beispielsweise, Brust oder Fingergelenke. Im Gegensatz zu nicht-invasiven Mikroskopietechniken, die Abbildung von oberflächlichen Ziele auf subzellulärer Auflösung 1 zu ermöglichen, erlaubt FMT dreidimensionale Rekonstruktion von Fluoreszenzquellen in Tiefen von mehreren Zentimetern, wenn auch in geringerer Auflösung 2. Viele gezielte Fluoreszenzsonden zur Verfügung, um Bild die Angiogenese, Apoptose, Entzündungen und andere 2-5. Einige Sonden sind aktivierbar, z. B. durch spezifische Enzymspaltung führt zu unquenching von Fluorochromen. Darüber hinaus können Reportergene exprimieren, fluoreszierende Proteine ​​abgebildet werden, beispielsweise auf Tumorzellmigration 6 verfolgen.

FMT stark profitiert von der Kombination mit einer anatomischen Modalität zB μCT 2,7 oder MRT 8. Während Stand-alone-FMT-Geräte sind im Handel erhältlich 9 sind die Fluoreszenzbilder schwierig, ohne anatomische Referenzinformationen zu interpretieren. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die fusionierten anatomischen Bilddaten ermöglicht eine robustere Analyse 10. Die anatomischen Daten können auch verwendet werden, wie die äußere Form der Maus, die für genaues optisches Modellieren und Fluoreszenzrekonstruktions 11 Vorwissen, bereitzustellen. Darüber hinaus können optische Streuung und Absorption Karten mit Segmentierung der Gewebearten geschätzt werden kann und durch die Zuordnung klassenspezifischen Koeffizienten 12,13. Für Nahinfrarotlicht ist Hämoglobin Hauptabsorber bei Mäusen neben Melanin und Pelz 14. Da die relative Blutvolumen variiert regional um Größenordnungen, ist ein Absorptions Karte besonders wichtig für die quantitative Fluoreszenz Rekonstruktion 13.

Ein Vorteil der Verwendung nicht-invasiver Abbildungsvorrichtungen ist, dass die Mäuse in Längsrichtung abgebildet werden, das heißt, zu mehreren Zeitpunkten. Dies ist wichtig, um das dynamische Verhalten von Sonden, also ihre Ziel Akkumulation, Bioverteilung und Ausscheidung 10,15 beurteilen, um die Progression der Erkrankung 16 beurteilen. Beim Abbilden mehrerer Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten wird eine große Menge von Bilddatensätzen entsteht. Um die Vergleichbarkeit zu ermöglichen, sollten diese in systematischer Weise, also erfasst, mit einer gut definierten und dokumentierten Protokoll. Die große Anzahl von Scans stellt eine Herausforderung für die Bildanalyse, die erforderlich ist, um quantitative Messungen von den Bilddaten zu extrahieren.

Das Ziel unserer Studie ist eine detaillierte Beschreibung eines μCT-FMT Bildgebungsprotokoll, das wir verwendet und optimiert über mehrere Studien 10,13,15,17,18 bereitzustellen. Wir beschreibenwie die Datensätze erzeugt werden, verarbeitet, visualisiert und ausgewertet. Dies zeigt sich unter Verwendung eines etablierten molekularen Sonde, OsteoSense, das bindet an Hydroxyapatit 19, und kann zu Bildknochenerkrankungen verwendet werden und Umbau 2. Alle Verfahren, die Tiere wurden von der staatlichen Prüfungsausschuss für Tierpflege genehmigt.

Protocol

Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der folgenden Schritte: Zuerst werden Phantome oder Mäuse und das multimodale Maus Bett zur Bildgebung bereit. Dann wird eine Ganzkörper-Scan im μCT erworben. Anschließend wird das Maus-Bett ist mit dem FMT wo zwei Scans werden (und umgedreht) erworben übertragen. Dies kann für mehrere Mäuse zu mehreren Zeitpunkten wiederholt werden. Nach Abschluss der Datenerfassung, müssen die Daten exportiert und sortiert, um automatische Segmentierung (Definiens eine Software-Lizenz erforderlich), sowie Bildfusion und Fluoreszenz-Rekonstruktion (ein Imalytics Präklinische Software-Lizenz erforderlich ist) zu ermöglichen. Schließlich wird gezeigt, wie das multimodale Datensätze visualisiert werden und wie Organe interaktiv segmentiert, um die biologische Verteilung der fluoreszierenden Sonden quantifizieren. 1. Phantom Vorbereitung HINWEIS: Phantoms sind nützlich, um das Abbildungssystem zu prüfen, sondern auch, um die Kalibrierung zu bestimmen factor für eine neue Sonde. Eine Lösung aus 200 ml Wasser, 2% igen, 1,8 g TiO 2 -Pulver, 50 ul Trypanblau. Nach dem Kochen, füllen die Lösung in eine rechteckige Form, etwa von 8 cm Länge, 3 cm Breite und 1,5 cm Höhe. Bereiten Sie mehrere fluoreszierende Einschlüsse im Phantom mit Pipettenspitzen, die eine Mischung aus Fluoreszenz und μCT-Kontrastmittel. Um die Einschlüsse zu erstellen, schneiden Sie die Pipettenspitzen und versiegeln sie mit einem Feuerzeug. Nachdem die Lösung verfestigt wird, legen Sie die Einschlüsse in das Phantom. Weggeschnitten einige Teile des Phantoms, um eine unregelmäßige Form zu erreichen, und um es in die multimodale Maushalterung passen. Um den Kalibrierungsfaktor für eine neue Sonde zu bestimmen, sind einige Phantom Scans erforderlich. Hierzu wird der Standard FMT gestrichelt in Kombination mit bekannten Mengen der Sonde verwendet. Für eine erhöhte Genauigkeit, fügen 4% Lipid-Emulsion zu der Lösung, um den gleichen Streukoeffizienten im Inneren der Aufnahme als in der EmpfangsRest des Phantoms. Auch eine kleine Menge (2%) von μCT Kontrastmittel für einfachere Bildanalyse. 2. Maus Vorbereitung HINWEIS: μCT-FMT-Bildgebung erfordert besondere Vorbereitung einschließlich der Betäubung und Haarentfernung. Platzieren Sie die Maus auf Chlorophyll-freie Lebensmittel 7 Tage vor Bildgebung. Dies wird das Hintergrundsignal zu reduzieren und ist besonders wichtig für FMT Kanäle unterhalb 750 nm. Alle Tierversuche werden unter Vollnarkose durchgeführt. Um die Narkose einzuleiten, die Maus in eine Kammer mit 2% Isofluran in Luft (Durchfluss 5 l / min) gefüllt, bis die Maus beim Einschlafen. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung von sanften Zehe oder Kneifen Haut und durch Überprüfung Entspannung der Muskelspannung (z. B. Kiefermuskel). Auf die Anästhesie aufrecht zu erhalten, fortsetzen Isofluran Anwendung mit einem Schlauch, der auf der Nase der Maus platziert ist (2% Isofluran in Luft, Flussrate 1 l / min). Um Augen drynes verhinderns, verwenden vet Salbe auf narkotisierten Mäusen. Um Kontrastmittel zu injizieren, fixieren Sie die narkotisierten Maus auf einem Heizkissen mit Klebeband. Platzieren eines Katheters (Spritzennadel an einem Rohr angebracht ist) in die Schwanzvene injiziert und die Fluoreszenzkontrastmittel (beispielsweise 2 nmol, bei maximaler Injektionsvolumen von 5 ml / kg Körpergewicht, das heißt 150 ul einer 30 g Maus). Zur Abtastung eines behaarten Maus weist der Abtastbereich im Voraus enthaart werden. Verwenden Sie dazu einen Rasierer oder Enthaarungscreme. Einige Stämme von Mäusen können Ausschläge von der Enthaarungscreme zu entwickeln. Daher überwachen die Mäuse für Hautveränderungen und kontaktieren Veterinärpersonal für die Pflege, wenn nötig. Testen Sie auch die Toleranz auf einer kleinen Anzahl von Tieren bei der Verwendung von neuen Mausstämme. Halten Sie die Maus während μCT Bildgebung und FMT anästhesiert (2% Isofluran in Luft, Durchflussmenge 1 l / min). 3. Maus Bed Vorbereitung HINWEIS: μCT-FMT Scannen, verwenden Sie ein multimodalesMaus Bett, die beide in die μCT und der FMT passt. Vor der Bildgebung, die Maus reinigen Bett mit feuchten Tüchern. Verwenden Sie kein Ethanol, weil dies die Acrylglas beschädigen. Stellen Sie sicher, dass die Marker sind frei von Wasser, da dies die automatisierte Marker Erkennung beeinträchtigen. Öffnen Sie die Schrauben des multimodalen Maus Bett und das Oberteil zu entfernen. Befestigen Sie den Narkosegas Rohr auf der Maus-Bett und fixieren Sie es mit Klebeband. Setzen Sie den narkotisierten Maus in die Maus Bett und legte die Nase in die Gasröhre. Sicherstellen, dass der Kopf der Maus ist auf der Vorderseite Indikator für die Maus Bett (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Maus in der Mitte der Maus Bett optimal zu nutzen das Sichtfeld des FMT. Schließen Sie die Maus Bett und bis die Maus fest gehalten Schrauben festziehen. Stellen Sie sicher, kann die Maus ständig durch visuelle Überwachung der Brustatmung Bewegungen atmen. 4. μCT Imaging ANMERKUNG: Eine Ganzkörper-Scan wird mit der μCT durchgeführt. Die erzeugte anatomischen Daten zur Bildfusion erforderlich ist, für eine verbesserte Fluoreszenzrekonstruktion und Bildanalyse. Platzieren Sie die Maus Bett mit der Maus in die μCT. Stellen Sie sicher, dass die Maus in einer Weise, dass es geht "tail-first" in die μCT platziert. Dies ist wichtig für die automatisierte Fusion. Um Anästhesie aufrechtzuerhalten, wenn die μCT-Deckel geschlossen ist, schließen Sie die Rohre, um das Gas durch den Fall der μCT kanalisieren. Zuerst nehmen Sie den langen Schlauch von der Maus-Bett und hängen Sie es an den Anschluss an der Außenseite der μCT. Bringen Sie dann die verbleibende freie Ende an den Anschluss in der μCT. Fahren Sie mit der Maus in die μCT Bett. Sicherstellen, dass das Gasrohr nicht locker ist und nicht durch die sich drehende Gantry verfangen. Falls erforderlich, fixieren Sie es mit Klebeband. Stecken Sie den Schlauch in die Aussparung des Halters der Maus Bett. </li> Schließen Sie die μCT und erwerben ein Topogramm. Wählen Sie mindestens zwei Unterabtastungen, um einen wesentlichen Teil der Maus und die Maus Bett, die für die Fusion und den Wiederaufbau ist bedecken. Wählen Sie die μCT Scan-Protokoll namens HQD-6565-360-90, der 720 Projektionen mit 1032 x 1012 Pixel bei einer vollen Umdrehung die eine Scan-Zeit von 90 s pro Unterscan erwirbt. Röhrchen werden bei 65 kV Spannung und Strom 1,0 mA betrieben. Alternativ kann die Strahlendosis und Scandauer zu reduzieren, wählen Sie das Scanprotokoll SQD-6565-360-29 720 Projektionen, die mit 516 x 506 Pixeln mit Scanzeit 29 s pro Unterscan erwirbt. Starten Sie die μCT-Scan. Der blaue Balken zeigt den Fortschritt. Die Unterabtastungen anschließend erworben werden. Unterkühlung und Flüssigkeitsverlust kein Problem wegen der kurzen Untersuchungszeit von nur wenigen Minuten. Den Deckel der μCT beim Scannen nicht öffnen, weil dies automatisch den Scan unterbrechen, um den Benutzer vor zu schützenStrahlung. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel, schließen Sie das Narkose Rohr und lösen Sie die Mausbett aus der Halterung, um sie an die FMT transportieren. 5. FMT Imaging HINWEIS: Direkt nach μCT Abtastung wird die Maus in der FMT in zwei Konfigurationen (und auf dem Kopf), der für eine verbesserte Rekonstruktion Fluoreszenz zusammen verwendet werden abgetastet. Schalten Sie den Narkosegasversorgung (2% Isofluran in Luft, Durchflussmenge 1 l / min) für die FMT, bevor Sie den Maus-Bett in die FMT. Verwenden des FMT Steuerungssoftware, erstellen Sie eine Studiengruppe mit einer geeigneten Anzahl von Themen (dh Mäuse). Wählen Sie die Sonden, die für die Bildgebung (Verwendung OsteoSense für neuartige Sonden, die nicht aufgeführt sind) verwendet werden. Tragen Sie die multimodale Maus Bett mit der Maus an die FMT. Der lange flexible Narkosegasrohr hält den Gasstrom. Vor dem Einsetzen des Maus-Bett in die FMT, entfernen Sie vorsichtig das Rohr, da esnicht im Inneren des FMT benötigt. Vermeiden Sie es, die Schrauben der Maus Bett. Platzieren Sie die Maus in das Bett FMT mit dem roten Zeiger ersten ("kopfüber"). Dies ist wichtig für die Bildfusion, um im Einklang mit der μCT sein. Schließen Sie die FMT. Wählen Sie die richtige Studiengruppe und Thema. Wählen Sie den gewünschten Kanal des FMT (für OsteoSense 750EX, verwenden Sie die 750 nm-Kanal). Fügen Sie eine Beschreibung, z. B. "up" oder "down" und erwerben einen Überblick Scan durch Drücken von "Aufnahme". Dies erfasst einen Reflexions Bild des gesamten Sichtfeld. Achten Sie darauf, keine "Reflexions Images Only" ausgewählt, da es sonst nicht möglich ist, zu erwerben 3D scannt anschließend. Passen Sie die Bildparameter für die 3D-Scan. Vergrößern Sie das Sichtfeld, so viel wie möglich von der Maus enthalten. Üblicherweise wird der Kopf und Schwanz nicht ganz in das Blickfeld zu passen, aber. Klicken Sie auf "Advanced221; und überprüfen Sie die Imaging-Einstellungen. Eingestellt Abtastdichte bis 3 mm, und Empfindlichkeit gegenüber normalen Beleuchtungs min / max 5000 und 50000 auf. Klicken Sie auf "In den Wiederaufbau Warteschlange" und klicken Sie dann auf "Scan", um den Suchlauf zu starten FMT. Dies wird etwa 5 bis 15 Minuten dauern, abhängig von der Größe und Dicke der Maus, da längere Belichtungszeiten für dickere Gegenstände erforderlich. Das Gerät enthält einen beheizten Imaging-Kammer zu Unterkühlung zu vermeiden. Nach dem Scan-Flip die Maus Bett einschließlich der Maus auf den Kopf und eine weitere Überprüfung zu erwerben. Dies bietet zusätzliche Daten für das Fluoreszenz-Rekonstruktion. Wenn die μCT und die FMT-Scans abgeschlossen sind und die Maus erwacht aus der Narkose, nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Bewusstsein, zum Beispiel wiedererlangt, zum Spazierengehen oder Brustlage zu halten. 6. Bild Fusion und Wiederaufbau HINWEIS: Nach derBeendigung der μCT-FMT Scanning, beispielsweise am Ende der Studie, muss die erfassten Daten, die sortiert werden, um die automatische Bildfusions und Fluoreszenz Wiederaufbau zu ermöglichen. Um die Scans für die Weiterverarbeitung zu sortieren, erstellen Sie einen Ordner für die Untersuchung. Für jede μCT-FMT-Scan, erstellen Sie einen Unterordner, dessen Name mit der Maus ID und den Zeitpunkt, z. B. M01_02h. Für jede μCT-FMT scannen, exportieren Sie die FMT-Scans (oben und unten), wie .fmt Dateien und speichern Sie sie in das Unterverzeichnis mit Dateinamen mit der Endung entweder "_up.fmt" oder "_down.fmt". Jedes .fmt Datei enthält die erworbenen Rohdaten, also die von der Kamera, den Metadaten erfasst Anregungs- und Emissionsbilder wie die Belichtungszeiten, und die Fluoreszenz Rekonstruktion durch FMT erzeugt. Unter Verwendung der μCT Software eine Rekonstruktion mit isotropen Voxelgröße 35 & mgr; m. Wählen Sie eine glatte Rekonstruktionskern (T10). Passen Sie das Sichtfeld sodass die gesamte Maus-Bett mit den Markern abgedeckt ist. Wählen MIFX / RAW als Ausgabeformat und starten Sie den Wiederaufbau. Nachdem der Wiederaufbau abgeschlossen ist, verschieben Sie die μCT Rekonstruktion Dateien in das Unterverzeichnis des μCT-FMT-Scan. Exportieren Sie die μCT und FMT-Daten für alle Scans. Stellen Sie sicher, dass jedes Unterverzeichnis enthält zwei .fmt Dateien (oben und unten) und die μCT Wiederaufbau im MIFX / RAW-Format. Um Vollständigkeit zu überprüfen wählen Sie Menü-> CT-FMT> Überprüfen Sie mit Hilfe der Vollständigkeits Imalytics Präklinische Software. Eine Liste der Fehler könnte angezeigt werden, wie beispielsweise fehlende .fmt Dateien oder μCT Rekonstruktionen. Beheben Sie die Fehler, und überprüfen Sie die Vollständigkeit, bis alle Fehler behoben sind. Verwendung Menü-> CT-FMT> Einstellungen, überprüfen Sie den Servernamen des Definiens Software und gegebenenfalls einstellen. Der Standardwert ist http: // localhost: 8184, unter der Annahme, dass der Definiens-Software auf demselben Computer installiert ist. Im nächsten Schritt, um die au ausführen wird der Definiens-Software erforderlichMated Segmentierung des Maus-Bett und Marker. Klicken Sie auf Menü-> CT-FMT> Sicherungsgruppe in der Imalytics Präklinische Software zur automatisierten μCT-FMT-Fusion für die gesamte Studie durchzuführen. Dies dauert ein paar Minuten pro μCT-FMT scannen und die Ergebnisse in einem Ordner mit der Endung "Package" parallel zum Studium Ordner. Dieser enthält eine kleinere Teilmenge von Dateien (die μCT Daten und der verschmolzenen Hersteller bereitgestellten FMT Wiederaufbau), die für die weitere Analyse relevant sind. Klicken Sie auf Menü-> CT-FMT> Rekonstruieren Gruppe (FMT) in der Imalytics Präklinische Software, um die Fluoreszenz Wiederaufbau einschließlich der Erzeugung von Absorptions- und Streu Karten 13 durchzuführen. Obwohl die Verarbeitung GPU-beschleunigte 20, wobei jeder Rekonstruktion erfordert 1 bis 4 Stunden in Abhängigkeit von der Größe der Maus. Die Ergebnisse werden in den Paketordner gespeichert werden. Hinweis: Um einen höheren Durchsatz zu ermöglichen, zur Zeit führen wir diese Rekonstruktionen auf einer GPU-Cluster mit 56 GPUs. </li> 7. Bildanalyse WICHTIG: Um quantitative Messungen aus den Bilddaten zu extrahieren, wird die Segmentierung von Läsionen und Organe notwendig. Nachdem alle Datensätze verschmolzen und rekonstruiert, erstellen Sie eine Segmentierung für jedes μCT-Scans mit dem FMT Imalytics Präklinische Software. Legen Sie eine μCT-Datei als Unterlage und die Fluoreszenz-Datei als Overlay. Drücken Sie "3D" auf dem Volume-Rendering drehen und überprüfen den Datensatz. Segment die Lunge, klicken Sie auf Menü-> Classes-> Klasse hinzufügen, und erstellen Sie eine Klasse namens "tmp". Dies kann auch über das Kontextmenü durchgeführt werden. Erstellen Sie eine neue Klasse setzt es automatisch als Ausgabeklasse für die anschließende Segmentierung Operationen. Führen Sie eine Schwellenwertoperation Segment alle Regionen mit geringer Intensität in der μCT Datensatz (klicken Sie auf Menü-> Segmentation-> Thresholding-> Unten, und geben 600). Jetzt die Luft die tmp-Klasse enthält außerhalb des moverwenden, sondern auch das Lungengewebe. Erstellen Sie eine "Lung" Klasse. Führen Sie einen "Fill Region" Betrieb (Rechtsklick in die Lunge ein und wählen Sie Menü-> Füllen Region-> Füllen Region unbegrenzt), um die Lunge von der Außenluft zu trennen. Löschen Sie den tmp-Klasse, weil es nicht mehr benötigt wird. Segment konvexen Bereichen, z. B. der Blase, verwenden Sie den Scribble-Modus. Zunächst erstellen Sie eine Klasse "Blase". Drücken Sie F1, um alle Kritzeleien zu löschen. Unter Verwendung der Computer-Maus, ziehen Kritzeleien, die Grenzen der Blase abzugrenzen. Drücken Sie F3, um die Region von den Kritzeleien mit einer temporären Maske, die als rot-Overlay erscheint eingeschlossen zu füllen. Iterativ hinzufügen mehr Kritzeleien (in jeder Schneidorientierung) und drücken Sie F3, bis eine ausreichende Genauigkeit erreicht. Typischerweise sind Skizzen in 10 Scheiben ausreichend. Drücken Sie F4, um die temporäre Maske als "Blase" zu speichern. Gehen Sie wie folgt zu segmentierenanderen konvexen Bereichen wie dem Herzen und Nieren. In vielen Regionen, z. B. der Magen oder die Leber, die durch wenige konvexe Bereiche angenähert werden. Um Segment der Wirbelsäule, zunächst ein "Bone" Klasse. Wählen ContextMenu-> Thresholding-> oben, um eine Schwellenwertoperation durchzuführen, um alle hellen Voxel zu klassifizieren (z. B. über 1600) als "Knochen". Eine Region Füllvorgang würde Segment versagen die Wirbelsäule, weil sie mit vielen anderen Teilen des Gerüsts, z. B. den Rippen verbunden ist. Führen Sie ein paar Schneidvorgänge durch iteratives Zeichnung Kritzeleien und F2 drücken, um die Wirbelsäule aus dem Schädel, den Rippen und dem Kreuzbein zu trennen. Schließlich erstellen Sie eine Klasse "Spine" und führen Sie eine Region Füllvorgang, um die Wirbelsäule zu erhalten (Rechtsklick in die Wirbelsäule und wählen ContextMenu-> Füllen Region-> Füllen Region unbegrenzt). Speichern Sie die Segmentierung als eine Datei in the Unterordner des μCT-FMT-Scan. Verwenden Sie eine konsistente Namen, zB organs.seg, um die Stapelverarbeitung zu ermöglichen. Wählen Sie Menü-> Statistik-> Klasse Statistiken (Overlay), eine Tabellenkalkulation, die die mittlere Fluoreszenzintensität, die Lautstärke und den Gesamtbetrag (Produkt der mittleren und Volumen) für jede Klasse enthält generieren. Um eine einzelne Tabellenkalkulation, die die Werte für alle Regionen aller μCT-FMT-Scans erzeugen, klicken Sie auf Menü-> Batch-> Set Stapeleinstellungen und klicken Sie dann auf Menü-> Batch-> Batch-Statistiken. Dies vermeidet den Aufwand für die Erstellung und Zusammenführen von vielen Tabellenkalkulationsdateien, dh, eine für jede μCT-FMT-Scan. 8. Sondenkalibrierung Um den Kalibrierungsfaktor für eine Sonde zu berechnen, mehrere μCT-FMT Phantom Scans mit verschiedenen bekannten Mengen der Sonde erforderlich sind (siehe Schritt 1.4), z. B. mit 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol und 0 pmol. Scannen Sie die Phantome, wie beschriebenAbschnitte 4 und 5. Auch für Phantom-Scans, nach oben und unten in der FMT-Scans erforderlich. Exportieren Sie die Daten und führen Fusion und Rekonstruktion, wie in Kapitel 6 beschrieben. Segment die Aufnahme mit Hilfe der μCT Daten für jeden Scan durch Schwellen (über 1.200) und Region Füllung. Erzeugen Sie eine Tabelle mit den gemessenen Fluoreszenzwerte und zeichnen sie als Funktion der bekannten Mengen. Berechnen der Steigung einer linearen Regressionsanpassung. Dies ist der Kalibrierfaktor für die Sonde.

Representative Results

Wir wendeten die beschriebenen Protokoll, um die Bioverteilung einer gezielten Sonde OsteoSense, die Hydroxyapatit bindet bewerten. 3 Mäusen (C57BL / 6 ApoE – / – Ahsg – / – Doppel-Knockout-Mäuse, 10 Wochen alt) wurden abgebildet, bevor und 15 min, 2 h, 4 h, 6 h und 24 h nach iv Injektion von 2 nmol OsteoSense. Unsere Software erfasst automatisch die Marker in den Maus multimodalen Bett aufgebaut (Figur 1, Figur 2A, B), die Fusion der anatomischen μCT Daten mit dem Fluoreszenz Rekonstruktion vom FMT (2C, D) durchgeführt wird aktiviert. Da OsteoSense ist eine Sonde mit einem niedrigen Molekulargewicht, eine schnelle renale Ausscheidung und damit hohe Signal in der Harnblase wird erwartet. Schmelzen des Fluoreszenz Rekonstruktion des FMT wurden Probleme wie verlegt Signal außerhalb der Blase (2C, D). Diese Probleme treten auf, weil die FMT nicht die wahre Form der Maus wissen und nimmt eine Blockform. Our Rekonstruktion bestimmt die genaue Form der μCT Daten und erzeugt Streuung und Absorption Landkarten 13, um eine genauere Rekonstruktion Fluoreszenz mit besserer Signallokalisierung, was sich besonders für die Blase (2E, F) ist, zu ermöglichen. Um das rekonstruierte Fluoreszenz geeignete Regionen zuzuordnen, wir interaktiv segmentiert mehrere Organe mit unserer Software (Abbildung 3). Für jede der 18 Abtastungen wurden 7 Bereiche eingeteilt, basierend auf den μCT Daten, dh., Herz, Lunge, Leber, Nieren, der Wirbelsäule, des Darms und der Blase. Anschließend wurde die Software verwendet, um die mittlere Fluoreszenz-Konzentration für jede der 126 Bereiche zu berechnen. Glücklicherweise bietet die Software eine Batch-Modus, der alle Werte berechnet und speichert sie in einer einzigen Tabelle. Um die Fluoreszenzverteilung zu visualisieren, wurden 3D-Renderings für jeden Zeitpunkt erzeugt werden,mit vergleichbaren Fenstereinstellung (4A-F). Mit den quantifizierten Organwerte wurde die Bioverteilung durch Mittelung der Organwerte über den drei Mäusen (4G) berechnet. Die Pre-Scans, vor der Injektion erworbenen zeigte vernachlässigbare Hintergrundsignal. 15 Minuten nach der Injektion erschien das stärkste Signal in der Harnblase, wegen der schnellen renale Ausscheidung. An den darauffolgenden Zeitpunkten, die verbleibende Sonde an Knochen und Gelenken angesammelt hatte. Abbildung 1. Multimodal Maus Bed. (A) Die multimodale Maus Bett enthält zwei Acrylglasplatten, die eng mit der Maus festhalten. Das Anziehen ist mit zwei Schrauben eingestellt. Die Maus Bett enthält Marker (leer Löcher) für die Bildfusion. Narkosegas wird mit einem flexiblen Schlauch, der mit t fixiert geliefertAffen. (B) Die Maus Bett auf einer Metallhalterung befestigt und in der Mitte der rotierenden Gantry μCT gehalten. (C) Vermeiden Sie eine Lücke zwischen Maus-Bett und der Metallhalter, denn sonst werden die Marker können falsch zugeordnet werden, was zu fehlerhaften Fusion. Das Narkosegasrohr sollte dem Rohrverbinder befestigt werden. (D) Die Maus Bett sollte in der FMT mit dem vorderen ersten um einen korrekten automatischen Schmelz ermöglichen eingefügt werden. (E) Die Marker sichtbar für die FMT-Kamera, die für die automatische Erkennung und Markierung Fusion verwendet wird, sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Bildfusion und Wiederaufbau. (A, B) Marker und die äußere Form des mouse werden von dem automatisierten Segmentierungsalgorithmus bestimmt. (C, D) 15 min nach der Injektion von OsteoSense, eine beträchtliche Menge der Sonde wurde bereits in die Harnblase ausgeschieden worden. Nach dem Verschmelzen der Hersteller bereitgestellten Rekonstruktion mit der μCT Daten, werden Probleme sichtbar. Die meisten der Signal erscheint auf der Blase, aber nicht in der Blase und in der Luft einige Signal erscheint einmal. Dies geschieht, weil die FMT nimmt einen blockförmigen Maus. (E, F) Unsere verbesserte Fluoreszenz Rekonstruktion, mit der Form der Maus aus den μCT Daten abgeleitet, führt zu einer besseren Lokalisierung der Fluoreszenz in der Blase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Interactive Organ Segmentat. Ion (A) Um die Fluoreszenzverteilung zu quantifizieren, werden mehrere Organe segmentiert: Herz (rot), Lunge (pink), Leber (braun), Magen (beige), der Wirbelsäule (lila), Nieren (gelb), Darm (grün) und Harnblase (Gold). (B) Die Lunge, der im Vergleich mit dem umgebenden Gewebe stark kontrastiert wird, wird mit Schwellenwertbereich und Füllung segmentiert. (C) Round Organe wie die Blase, der Nieren und Herzen werden mit "Skizzen" segmentiert. (D) Orgeln mit komplexer Form, zB Leber und Magen sind segmentierte inkrementell mit Kritzeleien. Um Segment der Wirbelsäule wird eine hohe Schwelle zum Segment alle Knochen aufgebracht. Dann einige Knochen, z. B. die Rippen, weggeschnitten, bis die Wirbelsäule bleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.in-page = "always"> Abbildung 4: Bioverteilung. Um die Bioverteilung zu beurteilen, werden die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten (AF) gescannt. (A) Die Pre-Scan, vor der Injektion, zeigt wenig Hintergrundsignal in der 750 nm-Kanal. (B) 15 min nach der Injektion, eine beträchtliche Menge der Sonde schon in der Harnblase. (C) an der 2 h Zeitpunkt wird die Maus uriniert hat, die in einigen Fluoreszenz außerhalb der Maus führt. Zu späteren Zeitpunkten (DF), wird das Signal vorwiegend an den Knochen und Gelenke, dh., Im Rücken und den Knien. (G) Die quantifizierten Fluoreszenzkonzentration wird für ausgewählte Organe gezeigt.

Discussion

Wir beschreiben und anzuwenden ein Protokoll für die multimodale μCT-FMT-Bildgebung. Wir verwenden im Handel erhältlich und weit verbreitet FMT und μCT Geräte 3,11,15 – 17,21. Während sich das Protokoll erfordert eine spezifische FMT, kann das von einem anderen μCT μCT mit ähnlicher Funktionalität und vergleichbare Scanparameter, zB ersetzt werden kann, sollte das Sichtfeld groß genug ist, um die Maus Bett einschließlich der Markierungen bedecken.

Das FMT für Bioverteilung Analyse ohne die Kombination mit μCT oder MRI-21 verwendet wurde, jedoch ist die anatomischen Daten von Vorteil, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, weil die Segmentierung auf der Organgrenzen, die in den μCT Daten 10 sichtbar sind basieren. Während integrierten μCT-FMT-Geräte wurden entwickelt, 2,7, sind diese nicht im Handel erhältlich. Weiterhin ist die Verwendung von zwei getrennten Geräten ermöglicht Rohrleitungen, das heißt., Die nächste Maus can im μCT abgebildet werden, während die erste Maus noch in der FMT, um den Durchsatz zu erhöhen.

Um den manuellen Arbeitsaufwand zu reduzieren, führen wir automatisierte Marker Erkennung und Fusion. Weiterhin wird die Mausform automatisch segmentiert und diese Information der Fluoreszenz Rekonstruktion 11,13,22 signifikant verbessert. Für die quantitative Fluoreszenz Rekonstruktion sind Absorptions- und Streupläne benötigt 13,23. Wir leiten die Streu Karte automatisierte Segmentierung der μCT Daten und Zuweisen bekannten Streukoeffizienten von mehreren Gewebetypen (Lunge, Knochen, Haut, Fett und übrigen Weichteile) 24. Anschließend rekonstruieren wir ein Absorptions Karte von der optischen Rohdaten, die besonders wichtig für die gut durchbluteten Organen wie dem Herzen und der Leber 13,20 ist.

Abtasten mehrerer Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten führt schnell zu einer großen Anzahl von Datensätzen zu analysieren. Für BiodisVerteilung Studien müssen mehrere Organe für jede μCT-FMT-Scan segmentiert werden. Leider kann die Segmentierungen nicht wiederverwendet werden, weil die Maus neu in den Maus Bett wiederholt positioniert. Wir benutzen ein Werkzeug für interaktive Segmentierung, an unserem Institut entwickelt wurde, aber auch andere Werkzeuge können auch entsprechende 25 sein. Wir generieren voxelweise Segmentierungen, da diese besser zu komplexen Organen als einfache Formen wie Ellipsen und Würfel 26 entsprechen. Automatisierte Ganztier Segmentierung wäre sinnvoll, um den manuellen Arbeitsaufwand 27 weiter zu reduzieren, aber eine interaktive Segmentierung Werkzeug immer noch erforderlich, um für die Segmentierung Fehler zu korrigieren. Darüber hinaus können automatische Segmentierung Werkzeuge kaum rechnen Sonderfälle wie Pathologien richtig. Da wir nativen μCT Scans einige Organe wie Milz sind sehr schwierig zu segmentieren, auch manuell. Kontrastmittel würde helfen, aber es gibt Probleme mit der Verträglichkeit, und es ist schwierig, der Wartung desna stetigen Kontrastmittelverteilung über die gesamte Längs Bildgebung.

Unsere Phantomstudie zeigt, dass die Signallokalisierung wird bei der Verwendung der Forminformation für Fluoreszenz Rekonstruktion verbessert. In vivo wird eine ähnliche Verbesserung offensichtlich für den frühen Zeitpunkt (15 min nach der Injektion), wenn eine große Menge der Probe ist bereits in der Harnblase. Die Hydroxyapatit-bindende Sonde sammelt sich an Knochen und Gelenken. Es ist bemerkenswert, wie schnell dies geschieht, das heißt, das Signal bereits in der Wirbelsäule 15 Minuten nach der Injektion deutlich sichtbar. Dies ist wahrscheinlich durch die geringe Molekulargewicht der Sonde, die schnelle Extravasation und Diffusion zu den Zielregionen ermöglicht verursacht. Die Sonde bindet kovalent an seine Ziel Hydroxyapatit und die ungebundene Sonde ausgeschieden. Für die späteren Zeitpunkten zwischen 6 h und 24 h nach der Injektion bleibt die Signalintensität in der Wirbelsäule relativ stabil ist, wahrscheinlich, weil kaum Licht reschmerzt tief in die Maus, um die Fluoreszenz zu bleichen. Für unsere Studie haben wir die 750 nm-Kanal, der in geringen Hintergrundfluoreszenz so offensichtlich für die vor der Injektion erworbenen Scans führt. Bei niedrigeren Wellenlängen, mehr Hintergrundsignal zu erwarten 28 werden.

Zusammengefasst beschreiben wir ein multimodales Bildgebungsprotokoll für handelsübliche FMT und μCT Geräte. Wir zeigen, dass die Kombination bietet Vorteile für die Fluoreszenz-Rekonstruktion. Wir veranschaulichen, wie die Bioverteilung Kurven aus der großen Menge von Bilddaten mit Hilfe von interaktiven Organsegmentierung und Stapelverarbeitung extrahiert. Wir glauben, dass diese standardisierten Workflow kann hilfreich für die Arzneimittelentwicklung und anderen bildgebenden Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Sonden sein.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Marek Weiler zum Durchführen der Phantomexperimenten. Diese Arbeit wurde durch den Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo) unterstützt, der deutschen Bundeslandes Nordrhein-Westfalen (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), der Deutschen Ministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (Förderprogramme Virtual Liver (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), der RWTH Aachen (I 3 TM Seed Fund) und Philips Research (Aachen, Deutschland).

Materials

FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX PerkinElmer FMT2000 Device for fluorescence molecular tomography
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo CT Imaging GmbH Tomoscope Duo Device for micro computed tomography
Multimodal Mouse Bed CT Imaging GmbH Experimental builder Partially transparent animal holder
IsoFlo (isoflurane, USP) Abbott 05260-05 Isoflurane Inhalation anesthesia
Small animal anesthesia system Harvard apparatus 726419 Complete Isoflurane Table-Top System
Chlorophyll-free mouse food Ssniff E15051 low chlorophyll / low fluorescence food
OsteoSense 750EX PerkinElmer NEV10053EX Animal FMT contrast agent
Portex Fine Bore Polythene Tubing Smith medical 800/100/120 Tube for injection catheter
Sterican 30g BBraun 4656300 Hypodermic needle for catheter
Imeron Altana pharma INLA F.1/0203/3.5337.69 CT contrast agent for the phantom inclusions
Agarose Sigma 90-12-36-6 Agarose for phantom production
TiO2 Applichem A1900,1000 Titanium oxyde as phantom scattering agent
Trypan blue Fluka 93595 Trypan blue to adjust phantom light propagation
Cy7 Lumiprobe 15020 Fluorochrome for the phantom inclusions
Lipovenoes 20% Fresenius Kabi 3094740 Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents
Definiens Developer XD Server Definiens AG Server XD Software platform for automated segmentation
Imalytics Preclinical ExMI/Gremse-IT Version 2.0.1 Software for image fusion, reconstruction and analysis
NVIDIA Geforce Titan Asus GTXTITAN6GD5 High end computer graphics card, 6GB Memory
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References

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Hybrid ImagingMultimodal ImagingFluorescence-mediated Tomography (FMT)Micro-computed Tomography (μCT)Image RegistrationFluorescence ReconstructionQuantitative AnalysisOrgan SegmentationBiodistribution

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Gremse, F., Doleschel, D., Zafarnia, S., Babler, A., Jahnen-Dechent, W., Lammers, T., Lederle, W., Kiessling, F. Hybrid µCT-FMT imaging and image analysis. J. Vis. Exp. (100), e52770, doi:10.3791/52770 (2015).
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