ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

プロトコルは、以下の手順の詳細な説明が含まれています。最初は、ファントムまたはマウスおよびマルチモーダルマウスのベッドは、撮像のために用意されています。そして、全身スキャンをμCTで取得されます。その後、マウスのベッドは2つのスキャンが（アップと逆さま）を取得するFMTに転送されます。これは、複数の時点で複数のマウスについて繰り返すことができます。データ取得が完了した後、データがエクスポートされ、自動セグメンテーション（定義するもののソフトウェアライセンスを必要とする）、ならびに画像融合および（Imalytics前臨床ソフトウェアライセンスを必要とする）蛍光再構成を可能にするためにソートされる必要があります。最後に、臓器が対話的蛍光プローブの生体内分布を定量化するためにセグメント化された方法をマルチモーダルデータセットが可視化され、どのように示されています。 1.ファントムの準備注：ファントムは、撮像システムをテストするのに有用であるが、事実上のキャリブレーションを決定します新しいプローブのR。 200ミリリットルの水、2％アガロース、1.8グラムのTiO 2粉末、50μlのトリパンブルーの溶液を調製します。煮沸した後、約8センチ長さ3センチ幅、1.5センチの高さの、長方形の形にソリューションをご記入ください。 蛍光およびμCT造影剤の混合物を含む、ピペットチップを使用して、仮想的に、いくつかの蛍光介在物を準備します。介在物を作成するには、ピペットチップを切断し、軽量化とそれらをシールします。 溶液が固化した後、ファントムに介在物を挿入します。不規則な形状を実現し、マルチモーダルマウスホルダーに収まるように、ファントムの一部を切り取ります。 新しいプローブの校正係数を決定するために、いくつかのファントムスキャンが必要とされています。このため、デフォルトFMTファントムは、プローブの既知の量と組み合わせて使用​​されます。精度向上のために、と含める内側同じ散乱係数を受信するための溶液に4％の脂質エマルジョンを追加ファントムの残りの部分。また、簡単に、画像解析のためμCT造影剤の少量（2％）を加えます。 2.マウスの準備注：μCT-FMTイメージングは​​、麻酔や脱毛などの特別な準備が必要です。 7日撮影前に、クロロフィルのない食品の上にマウスを置きます。これは、バックグラウンド信号を減少させ、750 nm以下のFMTチャネルのために特に重要であるだろう。 全ての動物実験は、麻酔下で行われます。マウスが居眠りするまで麻酔を開始するには、空気中の2％イソフルラン（流量5 L /分）で満たされたチャンバー内にマウスを置きます。穏やかなつま先や皮膚つまんで、筋肉の緊張（ 例えば 、顎の筋肉）の弛緩をチェックして、適切な麻酔を確認してください。麻酔を維持するために、（空気中の2％イソフルラン、速度1 L /分の流れ）は、マウスの鼻の上に配​​置されているチューブを使用してイソフルランアプリケーションを続けています。眼drynesを防止するためにSは、麻酔したマウスに獣医軟膏を使用しています。 造影剤を注入するために、テープを使用して、加熱パッド上で麻酔したマウスを修正。 （30gのマウスについて、すなわち 、150μL、5ミリリットル/ kg体重の最大注入量で、 例えば 、2ナノモル）を尾静脈にカテーテル（管に取り付けられた注射針）を配置し、蛍光造影剤を注入します。 有毛マウスを走査するため、走査領域は、事前に脱毛する必要があります。このため、シェーバーや脱毛クリームを使用しています。マウスのいくつかの株は、脱毛クリームの発疹を開発することができます。したがって、皮膚の変化のためのマウスを監視し、必要に応じてケアのための獣医学スタッフにお問い合わせください。新しいマウス系統を使用した場合も、少数の動物の耐性をテストします。 （速度1 L /分の流れ、空気中2％イソフルラン）μCTとFMTイメージング中に麻酔マウスを保管してください。 3.マウスのベッドの準備注：μCT-FMTスキャンの場合、マルチモーダルを使用μCTとFMTに両方にフィットするマウスのベッド、。 撮影前に、ウエットティッシュでマウス床を清掃してください。これはアクリルガラスを破損する可能性があるため、エタノールを使用しないでください。これは自動化されたマーカーの検出を損なう可能性があるため、マーカーは、水を含まないことを確認してください。 マルチモーダルマウスのベッドのネジを開き、上部を取り外します。 マウスのベッドの上で麻酔ガス管を取り付け、テープで固定します。 マウスのベッドに麻酔をかけたマウスを置き、ガス管に鼻を置きます。マウスの頭部は、マウスのベッドの前面インジケータ（ 図1）であることを確認します。 マウスを最適FMTの視野を使用するには、マウスのベッドの真ん中にあることを確認します。 マウスのベッドを閉じて、マウスがしっかりと固定されるまでネジを締めます。マウスが胸式呼吸の動きを視覚的に監視することにより着実に呼吸できることを確認してください。 4.μCTImaging NOTE：全身スキャンがμCTを用いて行われます。生成された解剖学的データは、画像融合のために、改良された蛍光の再構成のための画像解析のために必要とされます。 μCTにマウスでマウスのベッドを配置します。マウスは、それがμCTに「テール最初の "行くように配置されていることを確認します。これは、自動化された核融合のために重要です。 μCT-蓋が閉じているときに、麻酔を維持するためには、μCTの場合にガスを流すようにチューブを再接続します。最初のマウスのベッドから長い管を切り離し、μCTの外側にあるコネクタに接続します。そしてμCT内部コネクタに残りの自由端を接続します。 μCTにマウスのベッドを駆動します。ガス管が緩んでいないと回転ガントリーに引っ掛かることができないことを確認してください。必要に応じて、テープで固定します。マウスのベッドのホルダーのカットアウトにチューブを挿入します。 </lI> μCTを閉じて、トポグラムを獲得。融合と再構築のために重要であるマウスとマウスのベッドのかなりの部分をカバーするために、少なくとも2つのsubscansを選択します。 副走査あたり90秒のスキャン時間を必要とする1全回転の間に1032 X 1012ピクセルと720の突起を取得HQD-6565-360-90命名μCTスキャンプロトコルを選択します。管は、電圧65キロボルトと電流1.0ミリアンペアで動作されます。また、走査プロトコルSQD-6565-360-29スキャン時間で516のx 506ピクセルの720の突起副走査当たり29秒を取得選択し、放射線量及び走査時間を短縮します。 μCTスキャンを開始します。青いバーが進行状況を示しています。 subscansはその後、取得されます。低体温と流体損失があるため、わずか数分の短いスキャン時間の問題ではありません。これは自動的からユーザーを保護するためにスキャンが中断されますので、スキャン中にμCTの蓋を開けないでください放射。 スキャンが完了すると、ふたを開け麻酔チューブを再接続し、FMTにそれを輸送するためにホルダーからマウスのベッドを切り離します。 5. FMTイメージング注：直接μCTスキャンした後、マウスが改善された蛍光の再構築のために一緒に使用される2つの構成（アップと逆さま）にFMTに走査されます。 FMTにマウスのベッドを配置する前に、FMTのための（速度1 L /分の流れ、空気中2％イソフルラン）麻酔ガス供給をオンにします。 FMT制御ソフトウェアを使用して、被験者の適切な数（ すなわち 、マウス）を用いた研究グループを作成します。 （記載されていない新規のプロ​​ーブに使用OsteoSense）イメージングのために使用されるプローブを選択します。 FMTにマウスでマルチモーダルマウスのベッドを運びます。長い柔軟な麻酔ガス管は、ガス流を維持します。 FMTにマウスのベッドを挿入する前に、慎重にそれ以来、チューブを削除FMTの内側には必要ありません。マウスのベッドのネジを回すことは避けてください。 最初の赤のインジケータ（「ヘッド·ファースト」）とFMTにマウスのベッドを配置します。画像融合がμCTと矛盾しないようにするため、これは重要です。 FMTを閉じます。 正しい研究グループと対象を選択します。 FMT（OsteoSense 750EXのために、750 nmのチャネルを使用する）のに必要なチャンネルを選択します。 説明、 例えばを追加します。「上」または「下」と「キャプチャー」を押して、概要スキャンを取得します。これは、視野全体の反射画像を捕捉します。それ以外の場合は、その後の3Dスキャンを取得することができないので、選択された「反射率だけイメージ」を持っていないことを確かめて下さい。 3Dスキャンの撮像パラメータを調整します。マウスのできるだけを含むように視野を拡大します。通常、頭と尾は完全しかし、視野に収まらないだろう。 「詳細設定]をクリックします221;およびイメージングの設定を確認してください。それぞれ5000と50000の法線と照明最小/最大に3ミリメートル、感度に設定されたサンプリング密度。 「復興キューに追加」をクリックした後、FMTのスキャンを開始するには、「スキャン」をクリックします。より長い露光時間が厚いオブジェクトに必要とされるので、これは、マウスの大きさ及び厚さに応じて、約5 15分かかります。デバイスは、低体温を避けるために、加熱された撮影室が含まれています。 スキャン後、逆さまにマウスを含むマウスのベッドを反転し、別のスキャンを取得します。これは、蛍光の再構成のための追加データを提供します。 μCTとFMT-スキャンが完了し、マウスは麻酔から目覚めているとき、それは十分な意識を取り戻したまで、歩くか、または胸骨の横臥位を維持するために、 例えば 、無人のままにしないでください。 6.画像の融合と再構築注：後μCT-FMTスキャンが完了すると、 例えば 、試験の最後に、取得したデータは、自動化された画像融合および蛍光再構成を可能にするためにソートされる必要があります。 さらなる処理のためのスキャンを並べ替えるには、研究のためのフォルダを作成します。各μCT-FMTスキャンの場合、名前がマウスのIDと時刻、 例えば 、M01_02hが含まれている1サブフォルダを作成します。 各μCT-FMTは、スキャンの.fmtファイルとしてFMTスキャン（上下）をエクスポートし、「_up.fmt」または「_down.fmt」のいずれかで終わるファイル名を使用してサブフォルダに保存してください。各の.fmtファイルには、カメラで撮影した取得した生データ、 すなわち 、励起および発光画像、メタデータ、例えば、露光時間として、およびFMTにより発生する蛍光の再構築が含まれています。 μCTソフトウェアを使用して、等方性ボクセルサイズ35ミクロンとの再構成を作成します。円滑な復興カーネル（T10）を選択します。その視野を調整しますマーカーを含む全マウスの床が覆われていること。出力形式としてMIFX / RAWを選択し、再構築を開始します。再建が完了したら、μCT-FMTスキャンのサブフォルダにμCT再構成ファイルを移動します。 すべてのスキャンにμCTとFMTデータをエクスポートします。各サブフォルダは、2つの.fmtファイル（上下）とMIFX / RAW形式のμCT再建が含まれていることを確認してください。完全に確認するには>メニュー – > CT-FMT-を選択Imalytics前臨床ソフトウェアを使用して完全性を確認してください。エラーのリストは、このようなの.fmtファイルやμCT再構成を欠落しているように、表示される場合があります。エラーを修正し、すべてのエラーが解決されるまで、完全性をチェックします。 メニュー – > CT-FMT->設定を使用して、定義するものソフトウェアのサーバー名を確認し、必要に応じて調整します。デフォルトはhttp：// localhostを：8184、定義するもののソフトウェアが同じコンピュータにインストールされていると仮定します。ソフトウェア定義するものは、AUを実行するために次のステップで必要とされますマウスのベッドとマーカーのtomatedセグメンテーション。 全体研究のために自動化されたμCT-FMT融合を行うためにImalytics前臨床ソフトウェアでメニュー – > CT-FMT->ヒューズグループをクリックします。 μCT-FMTをスキャンし、検査フォルダに接尾辞「パッケージ」並列とフォルダ内の結果ごとにこの処理には数分かかります。これは、さらなる分析のために関連しているファイルのより小さなサブセット（μCTデータと融合したベンダー提供のFMTの再構築）が含まれています。 マップ13吸収の生成を含むと散乱蛍光再構成を実行するためにImalytics前臨床ソフトウェアでメニュー- > CT-FMT->再構築グループ（FMT）をクリックします。処理はGPUアクセラレーション20であっても、それぞれの再構築は、マウスのサイズに応じて1〜4時間を必要とします。結果は、パッケージフォルダに格納されます。注：より高いスループットを有効にするには、我々は現在、56 GPUを搭載したGPUクラスタ上でこれらの再構成を行います。 </li> 7.画像解析注：画像データから定量的な測定を抽出するために、病変および臓器のセグメント化が必要です。 一度すべてのデータセットが融合し、再構築され、各μCT-FMTのためのセグメンテーションを作成Imalytics前臨床ソフトウェアを使用してスキャンします。 アンダーレイとしてμCTファイルやオーバーレイなどの蛍光ファイルをロードします。を押し、「3D」は、ボリュームレンダリングをオンにして、データ·セットを検査します。 セグメントに肺、メニュー – >はクラス – >クラスを追加し、「TMP」という名前のクラスを作成します]をクリックします。これはまた、コンテキストメニューを介して行うことができます。新しいクラスを作成すると、自動的に後続のセグメンテーション操作用の出力クラスとして設定します。 （メニュー – > Segmentation-> Thresholding->の下をクリックし、600と入力します）μCTデータセット内の低強度の全ての領域をセグメントに閾値化操作を実行します。今TMPクラスはMO外の空気が含まれていますだけでなく、肺組織を使用しています。 「肺」クラスを作成します。 「領域を埋める」の操作を実行し、外の空気から肺を分離するために、（> Region-を記入無制限領域を塗りつぶし>肺に右クリックしてメニュー – を選択します）。 それはもはや必要ないため、TMPクラスを削除します。 セグメント凸部、 例えば 、膀胱に、落書きモードを使用します。ファーストクラス "膀胱"を作成します。 すべての落書きを削除するには、F1キーを押してください。 コンピュータのマウスを使用して、膀胱の境界を線引きする落書きを描きます。 F3キーを押して、赤のオーバーレイとして表示され、一時的なマスクで走り書きで囲まれた領域を埋めるために。反復（任意のスライス方向で）より走り書きを追加し、十分な精度が達成されるまでF3を押してください。典型的には、10スライスで落書きは十分です。 F4キーを押し、「膀胱」として一時的なマスクを格納します。 セグメントに次のように進んでください例えば、心臓や腎臓などの他の凸部。多くの領域は、 例えば 、胃や肝臓は、いくつかの凸状の領域によって近似することができます。 セグメント脊椎に、最初の "骨"クラスを作成します。 「骨」として、すべての明るいボクセル（ 例えば 、1,600以上）を分類するために閾値化操作を実行するためにContextMenu-> Thresholding->上を選択します。 それは骨格の多くの他の部分、 例えば 、リブに接続されているので、領域充填操作は、セグメントに背骨を失敗します。反復落書きを描き、頭蓋骨、肋骨、および仙骨骨から​​背骨を分離するためにF2キーを押して、いくつかの切断操作を実行します。 最後に、「スパイン」のクラスを作成し、脊椎（背骨に右クリックしてContextMenu-を選択> Region-を記入>無制限の領域を埋める）を取得するために地域の充填作業を行います。 目の内部ファイルとしてセグメンテーションを保存μCT-FMTスキャンの電子サブフォルダ。バッチ処理を可能にするために、organs.seg、 例えば 、一貫性のある名前を使用します。 メニュー – > Statistics->クラス統計（オーバーレイ）を選択し、各クラスの平均蛍光強度が含まれているスプレッドシート、ボリュームと合計金額（平均と体積の積）を生成します。 、すべてのμCT-FMTスキャンのすべての領域の値を含む単一のスプレッドシートを生成するメニュー – >バッチ – >設定バッチ設定をクリックし、メニュー – >バッチ – >バッチ統計をクリックします。これは、 すなわち 、それぞれのμCT-FMTスキャンのいずれかを、多くのスプレッドシートファイルを作成し、マージの手間を避けることができます。 8.プローブ校正プローブの校正係数を計算するために、プローブの異なる既知量を持つ複数のμCT-FMTファントムスキャンは、 例えば 、（ステップ1.4を参照）が必要です。、100ピコモル、50ピコモル、25ピコモルと0ピコモルで。 に記載されているようにファントムをスキャンFMTのセクション4およびファントムスキャンにも5、上下スキャンが必要とされています。 データをエクスポートし、第6章で説明したように融合し、再構成を行います。 セグメント（1200以上）閾値処理することによって、各スキャンのμCTデータを用いて封入し、領域充填。 測定された蛍​​光量のスプレッドシートを生成し、既知量の関数として、それらをプロットします。線形回帰フィットの傾きを計算します。これは、プローブの校正係数です。