JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

الهجين التصوير μCT-FMT وتحليل الصور

Published: June 04, 2015
doi:
10.3791/52770
, , , , , , ,
1Experimental Molecular Imaging,RWTH Aachen University, 2Institute for Biomedical Engineering – Biointerface Laboratory,RWTH Aachen University, 3Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences,Utrecht University

Summary

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Abstract

بوساطة مضان التصوير المقطعي (FMT) يمكن تحديد الطولي والكمي للتوزيع مضان في الجسم الحي، ويمكن استخدامها لتقييم biodistribution تحقيقات جديدة وتقييم تطور المرض باستخدام المجسات الجزيئية المنشأة أو الجينات المراسل. الجمع مع طريقة التشريحية، على سبيل المثال، التصوير المقطعي الصغيرة (μCT)، هو مفيد لتحليل الصور وإعادة الإعمار مضان. وصفنا بروتوكول لالمتعدد الوسائط التصوير μCT-FMT بما في ذلك الخطوات اللازمة لمعالجة الصور استخراج القياسات الكمية. بعد إعداد الفئران وإجراء التصوير، ويتم تسجيل مجموعات البيانات متعددة الوسائط. بعد ذلك، يتم إجراء تحسن إعادة الإعمار مضان، والتي تأخذ في الاعتبار شكل الماوس. للتحليل الكمي، الإنقسامات الجهاز يتم إنشاؤها استنادا إلى البيانات التشريحية استخدام لدينا أداة تجزئة التفاعلية. وأخيرا، فإن مكعب biodistributionيتم إنشاء rves باستخدام ميزة تجهيز الدفعات. نقدم لك مجموعة من تطبيق هذه الطريقة من خلال تقييم biodistribution من التحقيق المعروفة التي تربط العظام والمفاصل.

Introduction

بوساطة مضان التصوير المقطعي، وتسمى أيضا مضان التصوير المقطعي الجزيئي (FMT)، هي تقنية واعدة لتقييم كمي لتوزيع مضان في الأنسجة المنتشرة، مثل الفئران تخدير أو حتى أنسجة الجسم البشري، على سبيل المثال، الثدي أو مفاصل الأصابع. وعلى النقيض من تقنيات الفحص المجهري غير الغازية، والتي تسمح للتصوير أهداف سطحية في قرار التحت خلوية 1، FMT يسمح إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من مصادر الفلورسنت في أعماق عدة سنتيمترات، وإن كان ذلك في انخفاض القرار 2. تتوفر لتكوين الأوعية الدموية الصورة، موت الخلايا المبرمج، والالتهابات، وغيرها العديد من 2 تحقيقات الفلورسنت المستهدفة – 5. بعض المجسات هي activatable، على سبيل المثال،. قبل الانقسام انزيم معين مما يؤدي إلى unquenching من fluorochromes. وعلاوة على ذلك، جينات مراسل معربا عن البروتينات الفلورية ولا يمكن تصوير، على سبيل المثال، لتتبع هجرة الخلايا السرطانية 6.

FMT تستفيد بقوة من مزيج لطريقة التشريحية، على سبيل المثال، μCT 2،7 أو MRI 8. بينما الأجهزة FMT مستقل تتوفر 9 تجاريا، والصور مضان يصعب تفسيرها دون معلومات مرجعية التشريحية. مؤخرا كنا قادرين على إظهار أن تنصهر بيانات الصورة التشريحية يمكن تحليل أكثر قوة 10. ويمكن أيضا البيانات التشريحية أن تستخدم لتوفير المعرفة السابقة، مثل الشكل الخارجي للفأرة، وهو أمر مهم للنمذجة البصرية دقيقة ومضان إعادة الإعمار 11. وعلاوة على ذلك، وتشتت وامتصاص الخرائط البصرية يمكن تقديرها باستخدام تقسيم أنواع الأنسجة وعن طريق تعيين معاملات فئة معينة 12،13. لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة، الهيموجلوبين هو امتصاص الرئيسي في الفئران، بالإضافة إلى مادة الميلانين، والفراء (14). منذ حجم الدم النسبي يختلف إقليميا من حيث الحجم، وهي خريطة امتصاص أهمية خاصة بالنسبة لتشيوانtitative إعادة الإعمار مضان 13.

ومن مزايا استخدام أجهزة التصوير غير الغازية هي أن الفئران يمكن تصوير طوليا، أي عند نقاط زمنية متعددة. وهذا أمر مهم لتقييم السلوك الديناميكي للتحقيقات، أي تراكم هدفهم، biodistribution وإفراز 10،15، أو لتقييم تطور المرض 16. عندما التصوير عدة الفئران عند نقاط زمنية متعددة، وكمية كبيرة من مجموعات البيانات صورة ينشأ. تمكن من المقارنة، وهذه ينبغي الحصول عليها بطريقة منهجية، أي مع بروتوكول محددة جيدا وموثقة. عدد كبير من عمليات الفحص يشكل تحديا للتحليل الصور، وهو الأمر المطلوب لاستخراج القياسات الكمية من بيانات الصورة.

الغرض من الدراسة هو تقديم وصفا مفصلا لبروتوكول التصوير μCT-FMT التي كنا والأمثل في جميع أنحاء عدة دراسات 10،13،15،17،18. وصفناكيفية إنشاء مجموعات البيانات ومعالجتها، تصور، وتحليلها. وهذا ما يتجلى ذلك باستخدام المسبار الجزيئي المعمول بها، OsteoSense، التي تربط لهيدروكسيباتيت 19، ويمكن استخدامها لأمراض العظام وإعادة تشكيل صورة 2. وتمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات من قبل لجنة المراجعة الحكومية في رعاية الحيوان.

Protocol

ويتضمن البروتوكول وصفا مفصلا للخطوات التالية: في البداية، يتم إعداد الأشباح أو الفئران والسرير الماوس المتعدد الوسائط للتصوير. ثم يتم الحصول على مسح كامل الجسم في μCT. بعد ذلك يتم نقل السرير الماوس إلى FMT حيث يتم الحصول على اثنين من مسح (صعودا ورأسا على عقب). هذا يمكن أن يتكرر بالنسبة للفئران متعددة في نقطة زمنية متعددة. بعد الانتهاء من جمع البيانات، يحتاج البيانات التي يتم تصديرها وفرزها لتمكين تجزئة الآلية (التي تتطلب الحصول على ترخيص برنامج Definiens)، وكذلك صورة الانصهار وإعادة الإعمار مضان (تتطلب ترخيص البرمجيات Imalytics ما قبل السريرية). وأخيرا فإنه يظهر كيفية تصور مجموعات البيانات متعددة الوسائط، وكيف تم تقسيم أجهزة تفاعلي لقياس biodistribution من تحقيقات الفلورسنت. 1. إعداد فانتوم ملاحظة: الخيالات مفيدة لاختبار نظام التصوير، ولكن أيضا لتحديد المعايرة الواقعص لإجراء تحقيق جديد. إعداد محلول من الماء 200 مل، 2٪ الاغاروز، 1.8 غرام تيو 2 مسحوق، 50 ميكرولتر التريبان الأزرق. بعد الغليان، وملء الحل في شكل مستطيل، ما يقرب من 8 سم طول، 3 سم عرض، و 1.5 سم ارتفاع. إعداد عدة شوائب الفلورية في وهمي باستخدام نصائح ماصة، تحتوي على مزيج من مضان وμCT كيل التباين. لإنشاء الادراج، وقطع نصائح ماصة وختم لهم أخف وزنا. بعد أن عزز الحل، إدراج الادراج في الوهمية. قطع بعض أجزاء الوهمية لتحقيق شكل غير منتظم، وأنها تناسب لصاحب الماوس المتعدد الوسائط. لتحديد عامل المعايرة لإجراء تحقيق جديد، يطلب بعض بالاشعة الوهمية. لهذا، يتم استخدام الافتراضي FMT الوهمية في تركيبة مع كميات معروفة من التحقيق. للحصول على دقة زيادة، إضافة 4٪ دهن مستحلب إلى حل في الحصول على نفس معامل التشتت داخل إدراج كما فيبقية الوهمية. أيضا إضافة كمية صغيرة (2٪) من μCT عامل تباين لتسهيل تحليل الصور. 2. إعداد الماوس ملاحظة: يتطلب μCT-FMT التصوير إعداد خاص بما في ذلك تخدير وإزالة الشعر. ضع الماوس على خالية من الكلوروفيل الطعام قبل 7 أيام التصوير. هذا سوف يقلل من إشارة الخلفية ومهم بشكل خاص لقنوات FMT اقل من 750 نانومتر. يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات تحت التخدير. لبدء التخدير، ضع الماوس في غرفة مليئة 2٪ الأيزوفلورين في الهواء (معدل تدفق 5 لتر / دقيقة) حتى الماوس النوم. تأكيد التخدير المناسبة التي كتبها اصبع القدم لطيف أو الجلد معسر وعن طريق فحص تخفيف توترية العضلات (على سبيل المثال، العضلات الفك). للحفاظ على التخدير، والاستمرار في تطبيق الأيزوفلورين باستخدام أنبوب يوضع على الأنف من الفأرة (2٪ الأيزوفلورين في الهواء، ومعدل التدفق 1 لتر / دقيقة). من أجل منع drynes العينالصورة، استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني على الفئران تخدير. لحقن عامل تباين، وتحديد الماوس تخدير على وسادة التدفئة باستخدام الشريط. وضع (إبرة حقنة تعلق على أنبوب) القسطرة إلى الوريد الذيل وحقن عامل تباين فلوري (على سبيل المثال، 2 نانومول، مع حجم أقصى حقن 5 مل / كجم من وزن الجسم، أي 150 ميكرولتر لمدة 30 ز الماوس). لمسح ماوس شعر، منطقة المسح الضوئي لابد من نزعه مقدما. لهذا، استخدام آلة الحلاقة أو إزالة الشعر كريم. يمكن لبعض سلالات من الفئران تطوير الطفح الجلدي من كريم إزالة الشعر. لذلك، ومراقبة الفئران لإجراء تغييرات الجلد والاتصال موظفي البيطري للحصول على الرعاية إذا لزم الأمر. اختبار أيضا التسامح على عدد قليل من الحيوانات عند استخدام سلالات الفئران الجديدة. الحفاظ على الماوس تخدير أثناء μCT وFMT التصوير (2٪ الأيزوفلورين في الهواء، ومعدل التدفق 1 لتر / دقيقة). 3. ماوس سرير إعداد ملاحظة: للحصول على μCT-FMT المسح الضوئي، واستخدام المتعدد الوسائطسرير الماوس، الذي يناسب كلا في μCT وFMT. قبل التصوير، وتنظيف السرير الفأر مع الأنسجة الرطب. لا تستخدم الإيثانول لأن هذا قد يؤدي إلى تلف زجاج الاكريليك. تأكد من أن علامات خالية من الماء، لأن ذلك قد يضر الكشف علامة الآلي. فتح مسامير السرير الماوس المتعدد الوسائط وإزالة الجزء العلوي. نعلق أنبوب الغاز المخدر على السرير الماوس ويحملق ذلك مع الشريط. ضع الماوس تخدير في السرير الماوس ووضع الأنف في أنبوب الغاز. تأكد من رأس الفأر هو في مؤشر الأمامي للسرير الماوس (الشكل 1). تأكد من أن الفأر هو في منتصف السرير الماوس لاستخدام الحقل على النحو الأمثل نظر FMT. إغلاق السرير الماوس وتضييق الخناق حتى يتم عقد الماوس بإحكام. تأكد من الماوس يمكن أن يتنفس بشكل مطرد خلال رصد البصري للحركات التنفس الصدري. 4. μCT Imaging ملاحظة: يتم إجراء مسح كامل الجسم باستخدام μCT. مطلوب البيانات التشريحية ولدت لصورة الانصهار، لتحسين إعادة الإعمار مضان وتحليل الصور. وضع السرير الفأر مع الماوس في μCT. تأكد من أن يتم وضع الماوس في الطريقة التي ستسير الامور "ذيل أولا" في μCT. وهذا أمر مهم للانصهار الآلي. من أجل الحفاظ على التخدير عند إغلاق μCT-غطاء، إعادة توصيل الأنابيب لتوجيه الغاز من خلال هذه القضية من μCT. أول فصل أنبوب طويل من السرير الماوس وضمها الى الموصل في الخارج من μCT. ثم نعلق نهاية خالية المتبقية إلى موصل داخل μCT. دفع السرير الماوس في μCT. تأكد من أن أنبوب الغاز ليست فضفاضة ولا يمكن أن ننشغل بها عملاقة دوارة. إذا لزم الأمر، يحملق ذلك مع الشريط. إدراج أنبوب إلى خفض التدريجي من صاحب السرير الماوس. </lI> إغلاق μCT والحصول على topogram. اختيار اثنين على الأقل subscans لتغطية جزء كبير من الفأرة والسرير الماوس، وهو أمر مهم للاندماج وإعادة الإعمار. حدد البروتوكول المسح μCT اسمه HQD-6565-360-90، التي تستحوذ على 720 التوقعات مع 1032 X 1012 بكسل واحد خلال دورة كاملة تتطلب وقت المسح من 90 ثانية لكل subscan. يتم تشغيلها الأنابيب في الجهد 65 كيلو فولت والحالي 1،0 مللي أمبير. بدلا من ذلك، للحد من جرعة الإشعاع والمسح الضوئي المدة، حدد البروتوكول المسح SQD-6565-360-29 التي تستحوذ على 720 التوقعات مع 516 X 506 بكسل مع الوقت المسح 29 ثانية لكل subscan. بدء المسح μCT. ويشير الشريط الأزرق التقدم. سيتم الحصول على subscans في وقت لاحق. انخفاض حرارة الجسم وفقدان السوائل ليست مشكلة لأن من مدة المسح قصيرة من بضع دقائق فقط. لا تفتح غطاء μCT خلال المسح لأن هذا سوف يقطع المسح تلقائيا لحماية المستخدم منالإشعاع. عندما يتم الانتهاء من المسح الضوئي، وفتح الغطاء، وإعادة توصيل أنبوب التخدير وفصل السرير الماوس من حامل لنقله إلى FMT. 5. FMT التصوير ملاحظة: مباشرة بعد μCT المسح الضوئي، ويتم فحص الماوس في FMT في طرازين (صعودا ورأسا على عقب) والتي تستخدم معا لتحسين إعادة الإعمار مضان. بدوره على امدادات الغاز مخدر (2٪ الأيزوفلورين في الهواء، ومعدل التدفق 1 لتر / دقيقة) لFMT قبل وضع السرير الماوس في FMT. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة FMT، إنشاء مجموعة الدراسة مع عدد مناسب من الموضوعات (أي الفئران). حدد تحقيقات التي سيتم استخدامها للتصوير (استخدام OsteoSense للتحقيقات الرواية التي لم يتم سردها). حمل السرير الماوس متعدد الوسائط مع الماوس إلى FMT. يحتفظ طويلة مرنة أنبوب الغاز مخدر تدفق الغاز. قبل إدخال السرير الماوس في FMT، وإزالة بعناية الأنبوب منذليست هناك حاجة داخل FMT. تجنب تحويل مسامير السرير الماوس. وضع السرير الماوس في FMT مع المؤشر الأحمر لأول مرة ("رئيس والعشرين"). وهذا أمر مهم للصورة الانصهار لتكون متسقة مع μCT. إغلاق FMT. حدد مجموعة الدراسة الصحيحة والموضوع. اختر القناة المطلوبة من FMT (لOsteoSense 750EX، استخدم القناة 750 نانومتر). إضافة وصف، على سبيل المثال، "حتى" أو "القاعدة" واكتساب المسح الشامل عن طريق الضغط على "لقطة". هذا يلتقط صورة الانعكاس من الحقل بأكمله نظر. تأكد من أن لا يكون "الانعكاس صور فقط" اختيار، لأنه بخلاف ذلك فإنه ليس من الممكن الحصول 3D بمسح في وقت لاحق. ضبط المعلمات التصوير لفحص 3D. توسيع مجال الرؤية لتشمل أكبر قدر ممكن من الفأرة. عادة، سوف الرأس والذيل لا يصلح تماما في مجال الرؤية، ولكن. انقر على زر "المتقدم221؛ وتحقق من إعدادات التصوير. تعيين كثافة العينات إلى 3 ملم، والحساسية للإضاءة طبيعية ودقيقة / ماكس 5000 و 50000 على التوالي. انقر على زر "إضافة إلى قائمة انتظار إعادة الإعمار" ثم انقر فوق "مسح" لبدء المسح الضوئي FMT. وهذا سوف يستغرق حوالي 5 إلى 15 دقيقة، اعتمادا على حجم وسمك من الفأرة، لأن هناك حاجة التعرض مرات أطول لكائنات أكثر سمكا. الجهاز يحتوي على غرفة التصوير ساخنة لتجنب انخفاض حرارة الجسم. بعد الفحص، والوجه السرير الماوس بما في ذلك الماوس رأسا على عقب والحصول على فحص آخر. وهذا يوفر بيانات إضافية لإعادة الإعمار مضان. عندما يتم الانتهاء من μCT وFMT-المسح الضوئي والماوس يستيقظ من التخدير، لا تتركه دون مراقبة حتى استعاد وعيه فإنه يكفي، على سبيل المثال، أن يتجول أو للحفاظ على الاستلقاء القصية. 6. صورة فيوجن والإعمار ملاحظة: بعدالانتهاء من المسح μCT-FMT، على سبيل المثال، في نهاية الدراسة، يحتاج البيانات التي حصل عليها ليتم فرزها لتمكين الانصهار صورة الآلي وإعادة الإعمار مضان. لفرز بالاشعة لمزيد من المعالجة، قم بإنشاء مجلد للدراسة. لكل فحص μCT-FMT، إنشاء فرعي واحد الذي يحتوي على ID الماوس ونقطة زمنية، على سبيل المثال، M01_02h الاسم. لمسح كل μCT-FMT، تصدير بالاشعة FMT (صعودا وهبوطا) كما .fmt الملفات وحفظها في المجلد الفرعي باستخدام أسماء تنتهي إما "_up.fmt" أو "_down.fmt". يحتوي كل ملف .fmt البيانات الخام المكتسبة، أي الإثارة وانبعاث الصور التي حصل عليها الكاميرا، والفوقية، مثل التعرض مرات، وإعادة مضان الناتجة عن FMT. باستخدام برنامج μCT، إنشاء إعادة الإعمار مع حجم فوكسل الخواص 35 ميكرون. حدد نواة إعادة الإعمار ناعمة (T10). ضبط مجال الرؤية لذلكأن السرير الماوس بأكمله بما في ذلك علامات وتغطيتها. حدد MIFX / RAW كما شكل الانتاج والبدء في عملية إعادة الإعمار. بعد الانتهاء من إعادة الإعمار، نقل الملفات إعادة الإعمار μCT في فرعي من الفحص μCT-FMT. تصدير البيانات μCT وFMT لجميع بالاشعة. تأكد من أن كل مجلد فرعي يحتوي على ملفين .fmt (صعودا وهبوطا) وإعادة μCT في / شكل الخام MIFX. للتحقق من اكتمال حدد القائمة-> CT-FMT-> التحقق من اكتمال باستخدام برنامج Imalytics ما قبل السريرية. قد تظهر قائمة من الأخطاء، مثل فقدان .fmt الملفات أو إعادة البناء μCT. إصلاح الأخطاء وتحقق للتأكد من اكتمالها حتى يتم حل كافة الأخطاء. باستخدام القائمة-> إعدادات CT-FMT->، تحقق من اسم الخادم من البرنامج Definiens وضبط إذا لزم الأمر. الافتراضي هو http: // المضيف المحلي: 8184، على افتراض أن يتم تثبيت البرنامج Definiens على نفس جهاز الكمبيوتر. مطلوب برنامج Definiens في الخطوة التالية لأداء الاتحاد الافريقيتجزئة tomated من السرير الماوس وعلامات. انقر القائمة-> CT-FMT-> مجموعة فيوز في البرنامج Imalytics ما قبل السريرية لأداء الآلية μCT-FMT الانصهار لكافة مراحل الدراسة. هذا يستغرق بضع دقائق في μCT-FMT مسح والنتائج في مجلد مع لاحقة "حزمة" موازية إلى المجلد الدراسة. هذا يحتوي على مجموعة فرعية أصغر من الملفات (البيانات μCT وإعادة FMT تنصهر المتوفرة من قبل البائع) التي هي ذات الصلة لمزيد من التحليل. انقر القائمة-> CT-FMT-> إعادة إعمار المجموعة (FMT) في البرنامج Imalytics ما قبل السريرية لأداء اعادة الاعمار مضان بما في ذلك الجيل من الاستيعاب ونثر خرائط 13. على الرغم من أن المعالجة 20 تسارع الجرافيك، يتطلب كل إعادة الإعمار 1-4 ساعة اعتمادا على حجم الماوس. سيتم تخزين النتائج في المجلد الحزمة. ملاحظة: لتمكين إنتاجية أعلى، ونحن أداء حاليا إعادة البناء هذه على كتلة GPU مع 56 وحدات معالجة الرسومات. </li> تحليل 7. صورة ملاحظة: لاستخراج القياسات الكمية من بيانات الصورة، لا بد من تقسيم الآفات والأجهزة. مرة واحدة كل البيانات وتنصهر مجموعات وأعيد بناؤها، وخلق تجزئة لكل μCT-FMT تفحص باستخدام برنامج Imalytics ما قبل السريرية. تحميل ملف μCT كما الأساس الذي تقوم عليه وملف مضان كما تراكب. اضغط على "3D" لتشغيل جعل حجم وتفقد مجموعة البيانات. لجزء من الرئة، انقر فوق القائمة-> Classes-> إضافة الطبقة، وخلق فئة تسمى "تمة". ويمكن أيضا أن يتم ذلك من خلال قائمة السياق. خلق طبقة جديدة تلقائيا بتعيين أنها الطبقة الناتج عن عمليات تجزئة اللاحقة. إجراء عملية العتبة إلى شريحة جميع المناطق مع كثافة منخفضة في مجموعة البيانات μCT (انقر القائمة-> Segmentation-> Thresholding-> أدناه وأدخل 600). الآن الطبقة تمة يحتوي الهواء خارج مواستخدام ولكن أيضا أنسجة الرئة. إنشاء "الرئة" الطبقة. إجراء "ملء منطقة" عملية (انقر بزر الماوس الأيمن في الرئة وحدد القائمة-> تعبئة كل إقليم> ملء المنطقة غير محدود)، للفصل بين الرئة من الهواء الخارجي. حذف الطبقة تمة لأنه لا حاجة بعد الآن. إلى مناطق محدبة الجزء، على سبيل المثال، المثانة، استخدم وضع خربشات. أولا إنشاء فئة "المثانة". اضغط F1 لحذف كافة الشخبطة. باستخدام فأرة الكمبيوتر، ورسم الشخبطة لترسيم حدود المثانة. اضغط F3 لملء المنطقة المحاطة الشخبطة مع قناع مؤقت والذي يظهر كما تراكب الأحمر. تكراري إضافة المزيد من الشخبطة (في أي اتجاه التقطيع) واضغط F3 حتى يتم التوصل إلى دقة كافية. عادة، الشخبطة في 10 شرائح كافية. اضغط F4 لتخزين قناع مؤقت "المثانة". المضي قدما مثل هذا الجزءالمناطق محدبة أخرى مثل القلب والكلى. كثير من المناطق، على سبيل المثال، المعدة أو الكبد، ويمكن أن يقترب من قبل عدد قليل من المناطق محدبة. لجزء من العمود الفقري، وإنشاء أول "العظام" الطبقة. حدد ContextMenu-> Thresholding-> قبل إجراء عملية العتبة لتصنيف كل voxels مشرق (على سبيل المثال، قبل 1600) بأنه "العظام". ومن شأن عملية ملء المنطقة تفشل في قطاع العمود الفقري بسبب اتصاله مع أجزاء أخرى كثيرة من الهيكل العظمي، على سبيل المثال، الأضلاع. تنفيذ بعض عمليات قطع طريق رسم تكرارا الشخبطة والضغط على F2 لفصل العمود الفقري من الجمجمة، الأضلاع، وعظم العجز. أخيرا، إنشاء فئة "العمود الفقري" وتنفيذ عملية ملء المنطقة للحصول على العمود الفقري (انقر بزر الماوس الأيمن في العمود الفقري وحدد ContextMenu-> تعبئة كل إقليم> ملء المنطقة غير محدود). حفظ تجزئة كملف داخل الالبريد فرعي من الفحص μCT-FMT. استخدام اسم ثابت، على سبيل المثال، organs.seg، لتمكين تجهيز الدفعات. حدد القائمة-> Statistics-> فئة إحصاءات (تراكب)، لإنشاء جدول الذي يحتوي على متوسط ​​كثافة مضان، وحجم والمبلغ الإجمالي (الناتج من المتوسط ​​والحجم) لكل فئة. لإنشاء جدول واحد يحتوي على قيم لجميع المناطق جميع بالاشعة μCT-FMT، انقر فوق القائمة-> Batch-> تعيين إعدادات دفعة وثم انقر فوق القائمة-> Batch-> إحصاءات دفعة. هذا يتجنب جهد لخلق ودمج العديد من ملفات جداول البيانات، أي واحدة لكل مسح μCT-FMT. 8. المسبار المعايرة حساب معامل المعايرة لجنة التحقيق، متعددة بالاشعة الوهمية μCT-FMT مع مطلوبة مبالغ مختلفة من التحقيق (انظر الخطوة 1.4)، على سبيل المثال، مع 100 بمول، 50 بمول، 25 بمول و0 بمول. مسح الأشباح كما هو موضح فييرجى ملء القسمين 4 و 5. أيضا لاجراء الفحوصات الوهمية، صعودا وهبوطا بالاشعة في FMT. تصدير البيانات وتنفيذ الاندماج وإعادة الإعمار كما هو موضح في القسم 6. الجزء إدراج باستخدام البيانات μCT لكل فحص من قبل العتبة (فوق 1200) ومنطقة التعبئة. إنشاء جدول مع المبالغ مضان قياس ورسم لهم وظيفة من مبالغ. حساب المنحدر من نوبة الانحدار الخطي. هذا هو عامل المعايرة للتحقيق.

Representative Results

طبقنا بروتوكول صفها لتقييم biodistribution لاستهداف التحقيق، OsteoSense، الذي يربط هيدروكسيباتيت. تم تصوير قبل و15 دقيقة، 2 ساعة، 4 ساعات، 6 ساعة، و 24 ساعة بعد الحقن الرابع من 2 نانومول OsteoSense 3 الفئران (الفئران خروج المغلوب مزدوجة و 10 أسابيع من العمر C57BL / 6 APOE – / – AHSG – – /). برنامجنا الكشف عن علامات صلب السرير الماوس المتعدد الوسائط تلقائيا (الشكل 1، الشكل 2A، B)، والتي مكنت مزيج من البيانات μCT التشريحية مع إعادة الإعمار مضان التي يؤديها FMT (الشكل 2C، D). منذ OsteoSense هو التحقيق مع الوزن الجزيئي المنخفض، وهو إفراز الكلى سريع وإشارة وبالتالي ارتفاع في المثانة البولية هو متوقع. الانصهار في إعادة الإعمار مضان من FMT كشف المشاكل مثل إشارة في غير محله خارج المثانة (الشكل 2C، D). تحدث هذه المشاكل لأن FMT لا نعرف الشكل الحقيقي للماوس وتفترض وجود شكل كتلة. أوويحدد إعادة الإعمار ص شكل دقيق من البيانات μCT ويولد تشتت وامتصاص خرائط 13 من أجل تمكين إعادة الإعمار مضان أكثر دقة مع أفضل توطين إشارة، وهو ما يتضح بشكل خاص لالمثانة (الشكل 2E، F). لتعيين مضان أعيد إلى المناطق المناسبة، ونحن مجزأة بشكل تفاعلي عدة أجهزة باستخدام برنامجنا (الشكل 3). لكل من 18 بالاشعة، 7 مناطق كانت مجزأة على أساس البيانات μCT، أي، القلب، الرئة، الكبد، الكلى، العمود الفقري والأمعاء والمثانة. بعد ذلك، تم استخدام البرنامج لحساب تركيز مضان يعني لكل من المناطق 126. لحسن الحظ، فإن البرنامج يوفر دفعة واسطة، والذي يحسب كل القيم ويوفر لهم في جدول واحد. لتصور توزيع مضان، تم إنشاء الاداءات 3D لكل نقطة زمنية،باستخدام إعداد النوافذ قابلة للمقارنة (الشكل 4A-F). باستخدام القيم الجهاز كميا، تم احتساب biodistribution عن طريق حساب متوسط ​​قيم الجهاز على الفئران الثلاثة (الشكل 4G). يمسح قبل المكتسبة قبل الحقن، وأظهر إشارة الخلفية ضئيلة. 15 دقيقة بعد الحقن، ويبدو أقوى إشارة في المثانة البولية، وذلك بسبب إفراز الكلى سريع. في نقطة زمنية لاحقة، وكان التحقيق المتبقية المتراكمة في العظام والمفاصل. الشكل 1. المتعدد الوسائط ماوس سرير. (A) السرير الماوس المتعدد الوسائط يحتوي على لوحين من الزجاج الاكريليك التي تمسك بإحكام الماوس. يتم تعديل تشديد باستخدام اثنين من البراغي. السرير الماوس يحتوي على علامات (الثقوب فارغة) لصورة الانصهار. يتم تزويد الغاز مخدر باستخدام أنبوب مرن التي تركز اهتمامها مع تيقرد. ويرد (B) السرير الماوس إلى حامل معدني والذي عقد في مركز الدورية μCT العملاقة. (C) تجنب وجود فجوة بين السرير الماوس وحامل معدني، لأن خلاف ذلك، وعلامات قد يتم تعيين بشكل غير صحيح مما يؤدي إلى انصهار غير صحيح. يجب أن يرفق أنبوب الغاز مخدر إلى أنبوب موصل. (D) يجب أن يتم إدراج السرير الماوس في FMT مع أول جبهة لتمكين الانصهار الآلي الصحيح. (E) وعلامات واضحة للكاميرا FMT، والذي يستخدم للكشف عن علامة الآلي والانصهار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. صورة فيوجن والإعمار. (A، B) العلامة والشكل الخارجي للمذكرة التفاهميتم تحديد حد ذاته من قبل خوارزمية تجزئة الآلي. (C، D) 15 دقيقة بعد حقن OsteoSense، وقد تم بالفعل تفرز كمية كبيرة من التحقيق في المثانة البولية. بعد دمج إعمار المتوفرة من قبل البائع مع البيانات μCT، مشاكل تصبح مرئية. أكثر من إشارة يظهر حول المثانة ولكن ليس داخل المثانة وحتى يظهر بعض الإشارات في الهواء. يحدث هذا لأن FMT يفترض ماوس على شكل كتلة. (E، F) لدينا تحسين إعادة الإعمار مضان، وذلك باستخدام شكل الماوس المستمدة من البيانات μCT، والنتائج في توطين أفضل لمضان داخل المثانة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. التفاعلية الجهاز Segmentat . أيون (A) لتحديد توزيع مضان، وقد تم تقسيم عدة أجهزة: قلب (الأحمر) والرئة (الوردي) والكبد (البني) والمعدة (البيج) والعمود الفقري (البنفسجية) والكلى (الصفراء) والأمعاء (الأخضر) والمثانة البولية (الذهب). (B) ومجزأة الرئة، وهو ما يتناقض بشدة مقارنة مع الأنسجة المحيطة بها، وذلك باستخدام العتبة ومنطقة التعبئة. وقد تم تقسيم (C) أجهزة جولة، مثل المثانة والكلى والقلب باستخدام "الشخبطة". (D) هيئات مع شكل أكثر تعقيدا، مثل الكبد والمعدة ومجزأة بشكل متزايد باستخدام الشخبطة. لجزء من العمود الفقري، يتم تطبيق عتبة عالية لشريحة جميع العظام. ثم بعض العظام، على سبيل المثال، يتم قطع الأضلاع، بعيدا، حتى يبقى العمود الفقري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <p class="jove_content" fo:keep-together.في صفحة = "دائما"> الرقم 4. Biodistribution. لتقييم biodistribution، يتم فحص الفئران في عدة نقاط الوقت (AF). (A) تفحص قبل، قبل الحقن، ويظهر إشارة الخلفية قليلا في القناة 750 نانومتر. (B) 15 دقيقة بعد الحقن، وقدرا كبيرا من التحقيق هو بالفعل في المثانة البولية. (C) في 2 ح نقطة زمنية، قد الماوس تبول، مما يؤدي في بعض مضان خارج الماوس. في نقطة زمنية لاحقة (DF)، تظهر إشارة الغالب في العظام والمفاصل، أي، في العمود الفقري والركبتين. يظهر (G) وتركيز مضان كميا لأجهزة المحدد.

Discussion

وصفنا وتطبيق بروتوكول متعدد الوسائط التصوير μCT-FMT. نستخدم FMT المتاحة تجاريا والمستخدمة على نطاق واسع والأجهزة μCT 3،11،15 – 17،21. في حين يتطلب البروتوكول FMT محددة، وμCT يمكن الاستعاضة عن μCT آخر مع وظائف مماثلة والمعلمات المسح قابلة للمقارنة، على سبيل المثال، يجب أن يكون مجال الرؤية كبيرة بما يكفي لتغطية السرير الماوس بما في ذلك علامات.

وقد استخدم FMT لتحليل biodistribution دون الجمع بين ذلك مع μCT أو MRI 21، ومع ذلك، فإن البيانات التشريحية هو مفيد لزيادة التكاثر لأن تجزئة يمكن أن يستند إلى حدود الجهاز التي يمكن رؤيتها في البيانات μCT 10. في حين أجهزة متكاملة μCT-FMT وقد وضعت 2،7، وهذه ليست متاحة تجاريا حتى الآن. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام جهازين منفصلين يسمح الأنابيب، أي، في كاليفورنيا الماوس القادمةن يتم تصويرها في μCT في حين الماوس الأول لا يزال في FMT، لزيادة الإنتاجية.

لتخفيف عبء العمل اليدوي، ونحن أداء كشف علامة الآلي والانصهار. علاوة على ذلك، مجزأة على شكل الماوس تلقائيا وهذه المعلومات يحسن بشكل كبير من 11،13،22 إعادة الإعمار مضان. لإعادة الإعمار مضان الكمي، هناك حاجة إلى الاستيعاب ونثر الخرائط 13،23. نستمدها خريطة نثر كتبها تجزئة الآلي للبيانات μCT وتعيين معاملات نثر يعرف العديد من أنواع الأنسجة (الرئة والعظام والجلد، والدهون، وتبقى الأنسجة اللينة) 24. وفي وقت لاحق، ونحن إعادة بناء مخطط الامتصاص من البيانات الخام البصري وهو أمر مهم جدا لأجهزة perfused لجيدا مثل القلب والكبد 13،20.

مسح عدة الفئران عند نقاط زمنية متعددة ينتج بسرعة في عدد كبير من مجموعات البيانات لتحليلها. لbiodisدراسات tribution، تحتاج عدة أجهزة لتكون مجزأة لكل مسح μCT-FMT. وللأسف، فإن الانقسامات لا يمكن إعادة استخدامها، لأن الفأر هو وضع حديثا في السرير الماوس بشكل متكرر. نستخدم أداة لتقسيم التفاعلية، وضعت في معهدنا، ومع ذلك، قد يكون من المناسب أيضا أدوات أخرى 25. نحن تولد الانقسامات-فوكسل الحكمة، لأن هذه المباراة أفضل لأجهزة معقدة من الأشكال البسيطة مثل الحذف ومكعبات 26. سوف الآلي تجزئة كامل الحيوان يكون مفيدا لزيادة خفض عبء العمل اليدوي 27، ولكن لا تزال هناك حاجة إلى أداة تجزئة التفاعلية لتصحيح أخطاء تجزئة. وعلاوة على ذلك، يمكن تقسيم الأدوات الآلية بالكاد توقع حالات خاصة مثل الأمراض بشكل صحيح. وبما أننا استخدام فحوصات μCT الأم، بعض الأجهزة مثل الطحال من الصعب جدا أن شريحة حتى يدويا. ان عوامل التباين مساعدة، ولكن هناك مشاكل مع التحمل وأنه من الصعب maintaiنا توزيع عامل تباين ثابت على مدار التصوير الطولي.

وتبين الدراسة الوهمية لدينا أن توطين إشارة تحسين عند استخدام المعلومات شكل لاعادة الاعمار مضان. في الجسم الحي، وتحسن مماثل واضح لنقطة زمنية في وقت مبكر (15 دقيقة بعد الحقن)، عندما كمية كبيرة من التحقيق هو بالفعل في المثانة البولية. يتراكم التحقيق ملزم هيدروكسيباتيت في العظام والمفاصل. ومن الملاحظ مدى سرعة حدوث ذلك، أي، في إشارة واضحة للعيان بالفعل في العمود الفقري 15 دقيقة بعد الحقن. وهذا ربما كان سببه انخفاض الوزن الجزيئي لجنة التحقيق، والتي تمكن تسرب سريع ونشرها إلى المناطق المستهدفة. التحقيق يرتبط تساهميا إلى هيدروكسيباتيت هدفه ويفرز التحقيق غير منضم. لحظات زمنية لاحقة، بين 6 ساعات و 24 ساعة بعد الحقن، وكثافة الإشارة في العمود الفقري لا تزال مستقرة نسبيا، على الأرجح، لأنه لا يكاد أي إعادة الخفيفةأوجاع في عمق الماوس لتبييض مضان. لدراستنا، استخدمنا القناة 750 نانومتر، مما يؤدي إلى انخفاض مضان الخلفية كما هو واضح للمسح تم الحصول عليها قبل الحقن. في موجات أقل، وأكثر إشارة الخلفية يمكن توقع 28.

باختصار، نحن تصف بروتوكول التصوير المتعدد الوسائط للالمتاحة تجاريا أجهزة FMT وμCT. وتبين لنا أن الجمع يوفر فوائد لإعادة الإعمار مضان. نحن لتوضيح كيف يتم استخراج منحنيات biodistribution من كمية كبيرة من البيانات صورة عن طريق التفاعلية تجزئة الجهاز وتجهيز الدفعات. ونحن نعتقد أن هذا العمل الموحد يمكن أن تكون مفيدة لتطوير الأدوية والفحوصات التصويرية الأخرى التي تستخدم تحقيقات fluorescently المسمى.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر ماريك ويلر لأداء التجارب الوهمية. وأيد هذا العمل من قبل المجلس الأوروبي للبحوث (ERC غرانت انطلاق 309495: NeoNaNo)، والدولة الاتحادية الألمانية شمال الراين ويستفاليا (NRW، High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-البرنامج لل (EFRE)؛ ForSaTum)، والألمانية وزارة التربية والتعليم والبحوث (BMBF) (برامج التمويل الكبد الظاهري (0315743)، LungSys (0315415C)، LungSys2 (0316042F)، Photonik Forschung دويتشلاند (13N13355))، وجامعة آخن (I 3 صندوق البذور TM)، والبحث فيليبس (آخن، ألمانيا).

Materials

FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX PerkinElmer FMT2000 Device for fluorescence molecular tomography
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo CT Imaging GmbH Tomoscope Duo Device for micro computed tomography
Multimodal Mouse Bed CT Imaging GmbH Experimental builder Partially transparent animal holder
IsoFlo (isoflurane, USP) Abbott 05260-05 Isoflurane Inhalation anesthesia
Small animal anesthesia system Harvard apparatus 726419 Complete Isoflurane Table-Top System
Chlorophyll-free mouse food Ssniff E15051 low chlorophyll / low fluorescence food
OsteoSense 750EX PerkinElmer NEV10053EX Animal FMT contrast agent
Portex Fine Bore Polythene Tubing Smith medical 800/100/120 Tube for injection catheter
Sterican 30g BBraun 4656300 Hypodermic needle for catheter
Imeron Altana pharma INLA F.1/0203/3.5337.69 CT contrast agent for the phantom inclusions
Agarose Sigma 90-12-36-6 Agarose for phantom production
TiO2 Applichem A1900,1000 Titanium oxyde as phantom scattering agent
Trypan blue Fluka 93595 Trypan blue to adjust phantom light propagation
Cy7 Lumiprobe 15020 Fluorochrome for the phantom inclusions
Lipovenoes 20% Fresenius Kabi 3094740 Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents
Definiens Developer XD Server Definiens AG Server XD Software platform for automated segmentation
Imalytics Preclinical ExMI/Gremse-IT Version 2.0.1 Software for image fusion, reconstruction and analysis
NVIDIA Geforce Titan Asus GTXTITAN6GD5 High end computer graphics card, 6GB Memory
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
  2. Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
  3. Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
  4. Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
  5. Ntziachristos, V., Tung, C. -. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
  6. Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
  7. Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
  8. Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
  9. Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
  10. Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
  11. Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011 (2012).
  12. Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -. H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006 (2010).
  13. Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
  14. Cheong, W. -. F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
  15. Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
  16. Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
  17. Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
  18. Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
  19. Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  20. Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
  21. Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594 (2011).
  22. Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
  23. Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
  24. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).
  25. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
  26. Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
  27. Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
  28. Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).

Tags

Hybrid ImagingMultimodal ImagingFluorescence-mediated Tomography (FMT)Micro-computed Tomography (μCT)Image RegistrationFluorescence ReconstructionQuantitative AnalysisOrgan SegmentationBiodistribution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gremse, F., Doleschel, D., Zafarnia, S., Babler, A., Jahnen-Dechent, W., Lammers, T., Lederle, W., Kiessling, F. Hybrid µCT-FMT imaging and image analysis. J. Vis. Exp. (100), e52770, doi:10.3791/52770 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image