Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Alan J. Fox; Matthew C. Hiemenz; David B. Lieberman; Shrey Sukhadia; Barnett Li; Joseph Grubb; Patrick Candrea; Karthik Ganapathy; Jianhua Zhao; David Roth; Evan Alley; Alison Loren; Jennifer J. D. Morrissette

doi:10.3791/52758

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

Published: September 20, 2016

doi:

10.3791/52758

Alan J. Fox¹, Matthew C. Hiemenz¹, David B. Lieberman¹, Shrey Sukhadia¹, Barnett Li¹, Joseph Grubb¹, Patrick Candrea¹, Karthik Ganapathy¹, Jianhua Zhao¹, David Roth¹, Evan Alley^2,3, Alison Loren^2,3, Jennifer J. D. Morrissette¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine,Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine,Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ³Abramson Cancer Center

Summary

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Abstract

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

Introduction

רצף הדור הבא (NGS) של דגימות אונקולוגיה קליניות הפך לזמין לציבור רחב יותר במהלך השנים האחרונות, עם ריבוי נקודות בספרות מדעית על החשיבות של זיהוי שינויים גנטיים למקד אליהם, סמנים מולקולריים חזויים / פרוגנוסטיים. לוח מנתח ומחקרי רצף exome שלמים מרובה גן בשני ממאירויות ^1,2 אפיתל המטולוגיות ³ התממשו למושג ההטרוגניות גידול והתפתחות משובטת כמו התקדמות מחלה ואת ההתקפים. בנוסף, בניגוד לטכנולוגיות מתחרות כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) או רצף סנגר, NGS יכול לזהות שינויים גנומיים ביותר בכל הגנים הסרטניים הרלוונטיים קליני יחיד assay ^4.

מרכז האבחון אישית בתחילה הושק עם שני פנלי NGS קליניים, לוח המטולוגי מותאם אישית (הרן-NGS לוח) וכן לוח הסרטן ה- off- מדף דגימות FFPE (Solid-NGS לוח) (ראה <strong> איור 1). לוחות אלו מכסים קליני אזורי עניין רלוונטיים או גבוהים של הגנים הנבחרים; לא כל הגנים או אקסונים מכוסים במלואן. Amplicons מופק על ידי הכלאת בדיקה ואחריו סיומת קשירה. האזורים הממוקדים הם מוגברים נוספים באמצעות PCR עם פריימרים כפולים באינדקס אוניוורסלי, המאפשרים עד 96 דגימות להיות ונקווה עבור סידור.

איור 1:. רשימה של גנים המקורים של הפנלים כני הספרייה מבוצע תוך שימוש בפורמט המותאם אישית לוח המטולוגי (לוח הרן-NGS) של 33 גנים או ה- off- המדף Amplicon סרטן הלוח (Solid-NGS) של 47 גנים. לא כל הגנים או אקסונים מכוסים במלואם, כפי שכמה amplicons עשוי לכסות רק נקודות חמות מסוימות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ A>

התוכן עבור הלוח הרן-NGS נגזר ממקורות מרובים, אבל שבמרכזה 16 גנים שעברו מוטציה ב לוקמיה מיאלואידית החריפה (AML) שתוארה קודם לכן כמו הוכחת רמה גבוהה של תועלת קלינית ^5. הלוח המוצק NGS הוא מיוצר באופן מסחרי עם האזורים הממוקדים המבוססים על גנים שעברו מוטציה נפוצה סרטן כפי שדווח הקטלוג של סומטיים מוטציות הסרטן (COSMIC) ⁶ מסד נתונים.

צעדים מרכזיים המאפיינים את זרימת העבודה הכוללת עבור NGS הקליני. לאחר קלינאי צווי מבחן, פתולוג קובע הלימות של הדגימה בעקבות ניתוח עבור אחוז הגידול נפח דגימה. במוסדנו, אנו דורשים לפחות 10% גידול עקב שיעור שגיאת רצף רקע ( "רעש") של הטכנולוגיה ואת היעילות של הגישה הממוקדת. אם הרקמה היא נאותה לבדיקה, הדנ"א הגנומי מופק. DNA זה נתונה אז בקרת איכות מרובה (קוו) צעדים. אם ה- DNA עובר QC, ספריית amplicon מופקת להפיק ולרצף. כתוצאת הנתונים מנותחים באמצעות צינור ביואינפורמטיקה ללא צורך במיקור חוץ. בעקבות ניתוח ביואינפורמטיקה, גרסאות נסקרות באופן ידני ופירשו עבור פתוגניות לפני שילובם דו"ח קליני. להלן נתאר שני מקרים שעברו עבודה קפדנית זו ובסופו של דבר ביאה לשינויים בניהול קליני.

מקרה 1 – Acute מיאלואידית לוקמיה

ביופסיה של מוח עצם מחול הייתה אבחוני AML, ללא התבגרות. מחקרים ציטוגנטית נשלחו על דגימת מח העצם והפגינו קריוטיפ נקבה נורמלי. היו 95% במחזור תקיעות נוכחיות, כך דגימת דם היקפית נשלחה לבדיקות אבחון אישית על הלוח הרן-NGS.

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא סרטן המטולוגית של השושלת מיאלואידית של תאי דם לבנים. הגילוישל מוטציות גנטיות ב AML הפך חשוב יותר ויותר עבור פרוגנוזה וטיפול, עם מוטציות גנטיות חוזרות מוכרות חשוב בפתוגנזה ופרוגנוזה ^7. מוטציות NPM1 ו CEBPA נקשרו עם סיכון פרוגנוסטי חיובי, בעוד כפילויות טנדם פנימיות (ITDS) ב FLT3 קושרו עם תוצאה ⁸ פחות טובה. גוף גדל והולך של ראיות תומך תפקיד פתוגניים למוטציות אלו ואחרות AML ^9.

מקרה 2 – אדנוקרצינומה ריאות

ביופסיה של מסת supraclavicular שמאל מ- B החולה הפגינה אדנוקרצינומה ריאתית. חומר ביופסיה מגוש הבלוטה לימפה פרפין מוטבע קבוע פורמלין (FFPE) נשלח לבדיקת גנומי (לוח המוצק NGS) כמו לחמניות / תלתלים עם יותר מ -50 גידולים%, כדי לזהות אם מוטציה נכחה להתערבות טיפולית ממוקדת.

ריאות cancאה הוא הגורם המוביל לתמותה מסרטן בארצות הברית, והוא מחולק לשני סוגים עיקריים, סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) וסרטן ריאות מסוג תאים קטנים (SCLC). NSCLC יכול להיות מוגדר נוסף כמו גם אדנוקרצינומה או קרצינומה של תאי קשקש, מבוסס על היסטולוגיה של הנגע. אדנוקרצינומה הריאות היא תת הסוג הנפוץ ביותר של סרטן הריאות, לראות הן מעשנים ושאינם מעשנים, ו היא הצורה הנפוצה ביותר של סרטן הריאות במשך ¹⁰ מעשנים. מחקרים מולקולריים של אדנוקרצינומה ריאות זיהו מוטציה אונקוגנים מספר ^11. מוטציות הנהג הנפוצות ביותר שאותרו אצל מעשנים הן מוטציות KRAS ו BRAF. המוטציות הנפוצות ביותר לא מעשנים הן מוטציות EGFR, ו rearrangements מעורב הגנים ALK, RET ו ROS1. גידולי ריאה תוארו עם כניסה בתוך מסגרת אקסון 20 ב ERBB2 הגן (HER2 / neu). אי נורמלי הנפוצה ביותר HER2 / neu היא הגברה של מוקד זה בסרטן השד עבורו טיפול ממוקד זמין (trastuzumab: נוגדן מונוקלונאלי אנושי כנגד HER2 / neu). אקסון HER2 / neu 20 הכניסה כי הוא ציין 2 – 4% של הריאה adenocarcimomas ¹² הראה תגובה חלקית לטיפול בשילוב עם HER2 / neu ומעכבי mTOR (neratinib ו temsirolimus, בהתאמה) ^13.

Protocol

פרוטוקול זה כולל את השלבים הבולטים של שני מבחנים שפותחו במעבדה תוקפת עבור הפרופיל הגנטי של גידולים מוצקים ונוזליים, בהתאמה. הבדיקות שבוצעו במעבדה נעשו בהתאם לדרישות של תיקוני השיפור הקליניים מעבדתי (CLIA) של 1988. 1. הפקת DNA דם היקפי או מח עצם ברר כמה מח דם או עצם כדי לקחת מבוסס על לוח 1. לדוגמא / WBC סכום להתייחס אליהם כאל 1 מ"ל של דם מח עצם 250 μl דם WBC 12,000 – 50,000 1 מ"ל דם WBC 50,000 – 100,000 500 μl דם WBC 100,000 – 200,000 200 μl </ Td> דם WBC> 200,000 100 μl * דם WBC <12,000, לקחת 2 מ"ל של דם טבלת 1:. דם / מח העצם קבוצתי להשתמש תרשים מאז ספירת תאי הדם הלבנה תשתנה ממדגם לדגום, קשה לציין לנפח מסוים של דם לשימוש. לכן, כמות הדם להשתמש עבור assay צריכה להיקבע על ידי הסתכלות על ספירת תאי הדם הלבנים (WBC) לפני תחילת assay. אמנם פחות דם מנוצל, צריך עדיין להיות מטופלים כאילו שלה 1 מ"ל מאז נפח הדם המשמש מצטמצם כי מספר תאים הנמצאים גדול מהרגיל. פעל על פי הפרוטוקול של הערכה הזמינה המסחרי כדי לבודד את הדנ"א הגנומי. 2. הפקת DNA פרפין מוטבע קבוע פורמלין (FFPE) רקמות מבוסס עלבאזור הגידול הפתולוג הקיף בשקופית H & E, בשורת השקופיות בלא הכתם עם שקופיות מדריך H & E ו- להתוות שטח דומה עבור חילוץ. עבור לנתיחה המאקרו, תהליך רק דגימה אחת / הסט של מטופל שקופיות בכל פעם. מחממים את השקופיות על גוש חום C 45 ° עד מעט להמיס את פרפין. בזהירות לגרד את הרקמות בתוך הקווים מסומנים בשקופית, באמצעות אזמל חדש עבור כל דגימה להיעקר. מניחים את מה שאגר שעווה לתוך הצינור 1.5 מ"ל שכותרתו כראוי. היזהר מפני השעווה המגורדת היא אלקטרוסטטית מאוד ועלולה לקפוץ החוצה של הצינור. להוסיף 320 μl של Deparaffinization פתרון עבור כל חמש עד שישה 5 סעיפים מיקרומטר (25 – 30 מיקרומטר בסך הכל). לדוגמא, אם צינור המכיל 3 חלקים של 10 מיקרומטר גליל / סלסול הולך להיות מעובד, ולאחר מכן השתמשתי 320 μl, אבל אם 5 חלקים באותו העובי התקבלו מכן להשתמש 640 μl. וורטקס במרץ למשך 10 שניות לפחות ולבצע aqספין uick ב microcentrifuge כדי להסיר את הרקמה / שעווה מן הצדדים הכובע לתוך התמיסה. לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ולאחר מכן לדגור על RT במשך 5 -. 10 דקות. לאחר דגירה RT, להוסיף 180 μl של חיץ ATL לכל 320 μl של פתרון Deparaffinization הוסיף. לרכך את הרקמה עשר פעמים באמצעות מיני-עלי סטרילי באמצעות עלי חדש עבור כל דגימה. ודא שאין רקמות נדבקו העלי, כפי שהוא יכול להיות מאוד דביק. ההשעיה וורטקס במרץ במשך 3 שניות, ואז צנטריפוגות במהירות המרבית עבור 1 דקות. הוסף 10 μl של proteinase K לשלב ברור התחתון. מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה כדי להבטיח הרקמה resuspended. לא מערבולת. לדגור על 56 מעלות צלזיוס לילה עם רועד ב 400 – סל"ד 500. למחרת בבוקר, לבדוק אם הרקמה נמסה לגמרי (זה התרחש אם הפתרון הנמוך ברור). אם הפתרון הנמוך לא ברור, ואז מערבולת במרץ במשך 3 שניות ו צנטריפוגות במהירות מרבית FOr 1 דקות. להוסיף תוספת 5 – μl 10 של proteinase K ו לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך כ -30 – דקות 60. לדגור על 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לסייע להפוך את cross-linking פורמלדהיד. אפשר דגימות להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 5 – 10 דקות ולאחר מכן בקצרה צנטריפוגות צינור אחד לאחד את הנוזל. מעבירים את השלב ברור התחתון לתוך צינור 1.5 מ"ל שכותרתו. אם יש צינורות מרובים מאותה דגימת מטופל (כגון במקרה אם לחמניות מרובות נמצאות בשימוש), ולשלב מחדש את השלבים הנמוכים לתוך צינור אחד בשלב זה. הערה: העברת כמויות קטנות של פתרון Deparaffinization לא צריך להפריע הליך הטיהור, אבל קיים סיכון אם כמות גדולה מועברת. הוסף 2 μl של פתרון RNase. וורטקס בעדינות או להפוך 25 פעמים סיבוב מהיר ב microcentrifuge. לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 200 μl של פתרון משקעי חלבון. אם עושה לחמניות אחד או שניים, השתמש 200 μl. אם עושים שלושה רולשעות בבת אחת, ולאחר מכן השתמש 400 μl. וורטקס במרץ במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי לערבב מאגרים תמוגה אחיד. דגירה על קרח למשך 5 דקות או הדגימות יכולות להישאר על קרח עד יחס סיכון. צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 5 דקות. החלבון זרז צריך צורה כדורית חזקה, לבנה. יוצקים את supernatant לתוך צינור 1.5 מ"ל שכותרתו, ולאחר מכן דגירה דגימות על קרח דק 3 לפחות. צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 3 דקות. הוסף 200 μl של 2-propanol (איזופרופיל) לכל 180 μl של הצפת ATL הוסיף מוקדם יותר לצינור מ"ל 1.5 שכותרתו (זה עשוי להיות נחוץ כדי להשתמש צינור 2 מ"ל). לדוגמה, אם עושה שלוש לחמניות להוסיף 600 μl של isopropanol. הוסף 1 μl של גליקוגן לכל 180 μl של הצפת ATL הוסיף מוקדם יותר isopropanol ו להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב. בזהירות להוסיף את supernatant מהשלב משקעים חלבון לתוך התערובת Isopropanol. מערבבים את הצינור על ידי היפוך בעדינות לפחות 50 פעמים. צנטריפוגה ב sp המרביEED במשך 3 דקות. ה- DNA יהיה גלוי כמו גלולה לבנה קטנה בתחתית של התחתית. יוצקים או לשאוב את supernatant לתוך הצינור פסולת המתאים. שמור צינור 1.5 מיליליטר פסולת נפרד עבור כל דגימה במקרה הגלולה מגיע וחלץ אז זה לא יאבד או מעורבב עם הפסולת של דגימות אחרות. מסננים את הצינור על מגבת נייר ולהבטיח רוב Isopropanol מוסר. הוספת 300 μl של אתנול טרי 70%. הפוך את הצינור בעדינות כמה פעמים כדי לשטוף את הכדור. נסה לוודא הגלולה מגיע וחלץ כדי להבטיח ניקיון יסודי יותר. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 5 דקות. ולאחר מכן להסיר את אתנול בזהירות. הגלולה עשויה להיות רופפת, כך לשפוך או לשאוב באיטיות וצפי הגלול. הסר את אתנול העודף מהחלק הפנימי של הצינור, בלי לגעת הגלולה. אפשר דגימות אוויר יבש למשך 5 – 15 דקות, נזהר לא נגמר לייבש את המדגם. להוסיף בין 25 – 100 μl של DNA הידרציה פתרון לדוארACH מדגם בהתבסס על הגודל של גלולת DNA ואת הסכום ההתחלתי של רקמות. וורטקס צינורות במרץ בקצרה ספין ב microcentrifuge. דגירה עבור שעה 1 ב 65 מעלות צלזיוס רעננותם הדנ"א מלא. 3. בקרת איכות הדנ"א הגנומי הערה: ישנם שלושה שלבים עצמאיים עבור בקרת איכות DNA (קוו). ראה טבלה 2 להסבר נוסף מדוע כל צעד QC מתבצע. כלי תוֹצָאָה סִימָן אידיאלי טווח DropSense96 A260 / A230 זיהוי של מזהמים כימיים (למשל, אתנול) 1.50 – 2.2 DropSense96 A260 / A280 זיהוי של מזהמי חלבון 1.60 – 2.2 DropSense96 ריכוז כימות DNA > 1 ng / μl TapeStation DNA למרוח קביעת שלמות ה- DNA (למשל, שפלה / פיצול של DNA חילוץ) 50%> 1,000 נ"ב קיוביט 2.0 ריכוז עוד כימות DNA מדויקת > 1 ng / μl הטבלה 2:. DNA QC תוצאות צפויות כל הערכים הללו נלקחות בחשבון לפני הפעלת מתיר מדגם כדי להמשיך לשלב הכנת ספרייה. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, לרוץ 2 μl של ה- DNA שחולץ על fluorometer להשיג את ריכוז העבודה (ng / μl) של המדגם. הפעל 1 – 2 μl של כל דגימה על ספקטרופוטומטר UV / VIS כדי לבדוק את איכות המדגם (A260 / A230 וחולדה A260 / A280ios) על פי הוראות היצרן. לקבלת דוגמיות FFPE: בעקבות הוראות היצרן, לרוץ 1 μl של כל דגימה על מערכת ג'ל אלקטרופורזה microfluidic להעריך שפלה / פיצול של ה- DNA. ראה איור 2 דוגמאות. איור 2:. הדנ"א הגנומי QC ג'ל דוגמא הקו הירוק על הלהקות תחתונות כדי לציין את הסמן התחתון. המוסף-ב הקו האדום כדי לציין כ -1,000 נ"ב. ליין A2 מייצג DNA במלואו ללא פגם, כפי שניתן היה לצפות מן סו tis הטריה (למשל, דם היקפי או מח עצם). B1 Lanes, C1, D1, B2, C2, E2 הם דוגמאות DNA FFPE טוב, ללא פגע. הדנ"א F2 השביל שנראה תמים, אבל נמוך מדי ריכוז. הדנ"א G2 שביל הוא מושפל או מקוטע ולא יעבוד ב assay. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 לייצג DNA אשר נופל ב 'האזור האפור "כלומר assay יכול לעבוד גם, אבל חלק DNA יכול להינזק מדי או צולב ועל כן לא יבצעו היטב assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה. 4. הכנת הספרייה Amplicon הכלאה של אוליגו בריכה והארכת-קשירת oligos Bound בחדר Pre-PCR, להוסיף את הנפח של נמוך EDTA TE, 5 μl של Tube אוליגו של לוח (למשל, Solid-NGS לוח או הרן-NGS לוח), ו -100 – 250 ng של DNA גנומי לכל המקביל היטב שכותרתו היטב צלחת 96-עקפו חצי כמו צלחת הכלאה (היב). הוסף 40 μl של הכלאה אוליגו רצף מגיב 1 (OHS1) לדגום כל בצלחת היב. פיפטה בעדינות מעלה ומטה לפחות 5 – 6 פעמים כדי לערבב. טיפי שינוי לאחר כל עמודה כדי למנועזיהום צולב. חותם את הצלחת היב ברדיד אלומיניום צנטריפוגות דבק XG ב 1000 למשך 30 שניות. דגירה את צלחת היב בחממת ההכלאה המחוממת מראש על 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. הגדר את הטמפרטורה של חממת הכלאה עד 40 מעלות צלזיוס. המשך דוגר כל עוד זה לוקח בחממה כדי להקטין מ -95 ° C עד 40 ° C (~ 90 דקות). הערה: קירור הדרגתי זה הוא קריטי עבור הכלאה נאותה. במהלך 15 האחרונות – 20 דקות של הדגירה הכלאה, טרום לשטוף את יחידת פלייט מסנן (FPU). הכינו רק את הבארות שיש בשימוש assay הנוכחי, כלומר, רק להשתמש בבארות טריות / בשימוש של צלחת מסנן נפתחה בעבר, אבל מעולם לא שימוש חוזר בארות שנוצלו. הערה: זה צריך להיות ברור מבוסס על מספר הקיט על צלחת המסנן, הסימונים על צלחת המסנן, ואת האיטום בשימוש על פני הצלחת. בעזרת פיפטה רב ערוצית, להוסיף 45 μl של מחמירים לשטוף 1 (SW1) זה טוב. <br /> זהירות: מכיל לפוראמיד. כיסוי צנטריפוגות FPU ב 2,250 XG 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. בדוק היטב היטב יחיד עבור נוזל שיורים (> 15 μl / טוב). אם נוזל שיורים קיים, לסובב את ° FPU 180 וחזור על הצעד צנטריפוגה שוב למשך 3 דקות נוספות. אם הנוזל שהיורים מסתחרר בפעם השנייה, ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא, ואם לא אז ייתכן שיש פגם צלחת לסנן את הצלחת הנוכחית תהיה צורך להחליף. ברגע חממת ההכלאה מתקררת ל -40 מעלות צלזיוס, בצנטריפוגה הצלחת XG ב 1000 לפחות 30 שניות על 20 מעלות צלזיוס כדי לאסוף עיבוי. מעביר את כל הנפח של כל דגימה מצלחת היב גבי במרכז הבארות מראש השטף המקביל של FPU. שינוי עצות לאחר כל עמודה כדי למנוע זיהום צולב. מכסים את FPU צנטריפוגות ב 2,250 XG 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להוסיף 45 μl של SW1 ו צנטריפוגות ב 2,250 XG 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף. סובב את FPU 180 ° ו צנטריפוגות שוב ב 2250 XG במשך 3 דקות כדי להסיר כל SW1 לחלוטין. להסוות FPU. מחק את כל הזרימה דרך (המכיל לפוראמיד) לתוך מיכל פסולת הנכון. רכב את FPU באמצעות צלחת איסוף הפסול MIDI שונה. להוסיף 45 μl של יוניברסל הצפת 1 (UB1) זה טוב מדגם צנטריפוגות ב 2,250 XG 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. זהירות: מכיל לפוראמיד. להוסיף 45 μl של 3 מערבבים קשירת הרחבה (ELM3) מדגם היטב על הצלחת FPU ומעלה פיפטה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב. הערה: התגובה הרחבה-הקשירה מתרחשת על קרום צלחת מסנן. חותם את צלחת FPU ברדיד אלומיניום דבק דגירת הרכבת FPU כולו C חממה מחוממת מראש 37 מעלות במשך 45 דקות. אינדקס ו PCR הגברה Aliquot מדדה בשימוש כדי הבארות המקבילות Pl ההגברה באינדקסאכול (IAP) על ידי סידור פריימרים ב אבזר פלייט אינדקס, מסודרים באופן הבא: צינורות פריימר i5 (כובע לבן, פתרון ברור) אנכי, מתואמים עם שורות באמצעות H, צינורות פריימר i7 (מכסים כתומים, פתרון צהוב) אופקי , מיושר עם עמודות 1 עד 12. בעזרת פיפטה רב ערוצית P10, להוסיף 4 μl של פריימרים i7 (פתרון צהוב) בכל שורה של IAP ולהוסיף 4 μl של פריימרים i5 (פתרון ברור) כל עמודה של IAP. על קרח או בלוק קירור, להכין מיקס מאסטר PCR על ידי הוספת 0.5 μl של ה- DNA פולימראז 1 (TDP1) עד 25 μl של ה- PCR מיקס מאסטר 2 (PMM2) לדגימה. הפוך, במהירות מערבולת, בקצרה צנטריפוגות מיקס מאסטר PCR לערבב. להוסיף 22 μl של מיקס מאסטר PCR היטב כל של עד IAP פיפטה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב. שינוי עצות בין בארות. שמור את IAP על 4 מעלות צלזיוס. לאחר התגובה קשירת-הרחבה 45 דקות (שלב 4.1.10), להסיר את FPU מן החממה ובזהירות להסיר את אלuminum חותם אלומיניום. מכסים עם מכסה צנטריפוגות ב 2,250 XG 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הוסף 25 μl של 50 מ"מ NaOH מדגם זה גם על FPU. פיפטה מעלה ומטה לפחות 6 פעמים; להבטיח את הטיפים פיפטה לבוא במגע עם קרום. טיפי שינוי לאחר כל עמודה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. דגימות העברת eluted מן FPU אל IAP כדלקמן: בעזרת פיפטה רב ערוצי P100 מוגדר 20 μl, פיפטה NaOH על צלחת FPU מעלה ומטה לפחות 6 פעמים. הטה מעט את צלחת FPU כדי להבטיח שאיפה להשלים מהצלחת. העברת 20 μl מן FPU לעמודה המקביל IAP. פיפטה בעדינות מעלה ומטה לפחות 6 פעמים כדי לשלב את ה- DNA ביסודיות עם מיקס מאסטר PCR. חותם את IAP עם סרט דבק צנטריפוגות XG ב 1000 דקות 1 ב 20 מעלות צלזיוס. תביא את צלחת ה- PCR לתוך החדר פוסט-PCR ולטעון את הצלחת על גבי Cycler תרמית. הפעל את p PCRrogram המורכב חום denaturing צעד ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; ואחריו 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 62 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות; ואחריו סיומת סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; גמר עם להחזיק ב 10 ° C. אם לא שימשיך לשלב הבא לאחר השלים PCR, הצלחת יכולה להישאר על Cycler תרמית לילה, או שזה יכול להיות מאוחסן ב 2 עד 8 מעלות צלזיוס עד ימים. טיהור PCR ונורמליזציה חרוזים בהתבסס הסר את חרוזי טיהור המגנטיים, הצפת elution (EBT), ריאגנטים ג'ל אלקטרופורזה ממקרר 4 ° C והמקום ב RT לפחות 20 דקות לפני השלב הבא. לאחר PCR יושלם, צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 ב 20 ° C כדי לאסוף עיבוי. העברת 1 μl של כל תגובה PCR להתפשט צינורות / בארות צלחת המכילה 4 μl של מים כדי לדלל את דגימות 1/5. פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. הוסף 2 μl שלמדולל דגימות PCRed 2 μl של חיץ microfluidic-ג'ל. חותם את הרצועות / צלחת. Shake 1,800 סל"ד במשך לפחות 30 שניות ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 30 שניות. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, הפעל את התערובת על ג'ל microfluidic להעריך אם הכנת ספריית ניב ספרייה מקובלת (ראה איור 3). וורטקס חרוז טיהור המגנטית עד שהם-מושעים היטב הצבע נראה הומוגני. להוסיף 45 μl של חרוזים מדגם זה. חותם את הצלחת עם סרט דבק ברור ולנער את הצלחת ב -1,800 סל"ד במשך 2 דקות. דגירה בטמפרטורת החדר ללא רעד במשך 10 דקות. מניחים את הצלחת על דוכן מגנטי. לאחר supernatant יש פינה, להסיר בזהירות וזורקים supernatant. אם כל החרוזים הם aspirated בשוגג לתוך טיפים, לוותר החרוזים חזרה לצלחת ולתת לשאר צלחת על המגנט במשך 2 דקות ולאשר כי supernatant יש פינה. עם הצלחת על tהוא מעמד מגנטי, להוסיף 200 μl של אתנול 80% מוכנים טרי מדגם זה היטב. הזז את הצלחת הלוך ושוב כמה פעמים. דגירה את הצלחת על דוכן העדים המגנטיים למשך 30 שניות. מוציאים בזהירות וזורקים supernatant. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף. הסר את אתנול העודף ידי centrifuging את הצלחת בקצרה XG ב 1000 כדי להוזיל כל אתנול בצידי הצינור, הצבת הצלחת בחזרה על המעמד המגנטי, והשימוש טפטף רב ערוצית P10 מוגדר 10 μl להסיר את אתנול. אפשר חרוז-אוויר יבש 5 – 8 דקות. בעזרת פיפטה רב ערוצית P100, להוסיף 30 μl של EBT היטב כל אחד. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להבטיח את החרוזים באים מהצד של הצינור. חותם את הצלחת עם סרט דבק ברור ולנער את הצלחת ב -1,800 סל"ד במשך 2 דקות. דגירה בטמפרטורת החדר ללא רעד במשך 3 דקות. אם יש דוגמאות שבהן חרוזים הם לא resuspended לחלוטין, פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי resuspend את החרוזים. מניחים את הצלחת על דוכן מגנטי. בעזרת פיפטה רב ערוצי P100, להעביר 20 μl של supernatant לצלחת חדשה לגמרי שנקרא פלייט נורמליזציה הספרייה (LNP). מעבירים את הנותרים ~ 10 μl של ספריות רצף פרט לצלחת נפרדת בשם פלייט הספרייה והנקי שנותר (RCLP). אחסן צלחת זו יחד עם הכנה הספרייה הסופית, כפי שהוא יכול לשמש כעתודה לריצה רצף השני, אם יהיה צורך בכך. אם לא שתמשיך לשלב הבא, LNP ו RCLP ניתן לאחסן ב -15 עד -25 ° C. מערבולת במרץ ו resuspend 1 חרוזים נורמליזציה הספרייה (LNB1). זה קריטי כדי resuspend גלולה חרוז LNB1 לגמרי בתחתית של התחתית. מכינים את תערובת נורמליזציה, על ידי ערבוב 8 μl של LNB1 עם 44 μl של 1 תוספות נורמליזציה הספרייה (LNA1) לדגימה. בתוקף מערבולת Mix הנורמליזציה במשך 10 – 20 שניות. זהירות: LNA1 מכיל לפוראמיד. עם היפוך לסירוגיןnd vortexing של מיקס נורמליזציה, להוסיף 45 μl מדגם של LNP. חותם את הצלחת עם סרט דבק ברור ולנער את הצלחת ב -1,800 סל"ד למשך 30 דקות. הדגירה 30 דקות זה הוא קריטי עבור נורמליזציה הספרייה הראויה, כפי incubations של יותר או פחות מ -30 דקות עשויים להשפיע ייצוג הספרייה וצפיפות אשכול. במהלך הדגירה 30 דקות, להכין את ריאגנטים עבור סידור ידי הפשרת מחסנית מגיב היב הצפת (HT1) [זהירות: שניהם מכילים לפוראמיד]. בנוסף, מקבל קרח למשך בשלב מאוחר יותר ולהבטיח גוש חום מתאים צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל מוגדר 96 ° C. כאשר צעד ערבוב 30 דקות יושלם, למקם את LNP על דוכן מגנטי. לאחר supernatant יש פינה, השתמש פיפטה רב ערוצי להסיר בזהירות וזורקים supernatant לתוך המיכל פסולת המתאים. הסר את LNP מדוכן מגנטי ולשטוף את החרוזים עם נורמליזציה הספרייה לשטוף 1 (LNW1) כדלקמן: להוסיף 45μl של LNW1 מדגם זה היטב. זהירות: מכיל לפוראמיד. חותם את הצלחת עם סרט דבק ברור ולנער את הצלחת ב -1,800 סל"ד במשך 5 דקות. חזור עבור סכום כולל של שני שוטף. ודא כדי להסיר את כל LNW1 לאחר לשטוף את השני. הסר את LNP מדוכן מגנטי, בעזרת פיפטה רב ערוצית, להוסיף 30 μl של 0.1 N NaOH (פחות משבוע) זה טוב כדי elute המדגם. חותם את הצלחת עם סרט דבק ברור ולנער את הצלחת ב -1,800 סל"ד במשך 5 דקות. במהלך elution 5 דקות, להוסיף 30 μl של נורמליזציה הספרייה אחסון הצפת 1 (LNS1) זה טוב כדי לשמש צלחת חדשה בשם פלייט אחסון (SGP). מניח את LNP על המעמד המגנטי. לאחר supernatant יש פינה, להעביר את elution 30 μl אל LNS1 ב SGP. שינוי עצות בין דגימות כדי למנוע זיהום לחצות. חותם את הצלחת עם סרט דבק צנטריפוגות XG ב 1000 עבור 30 שניות לפחות. הוסף 5 1; l של כל דגימה להיות רצף לספריה Amplicon משולב שכותרתו (PAL) צינור 1.5 מ"ל. וורטקס PAL לערבב ומסובב בקצרה microcentrifuge. בהתאם בשימוש מה כימיה ריצוף (V2 או V3) להוסיף 4 – 10 μl של PAL ל 590 – 596 μl של HT1. באופן כללי, להוסיף 5.8 μl של PAL ל 595 μl של HT1 לכימיה V2 ו -8.5 μl של PAL ל 592 μl של HT1 לכימיה V3. לייבל הצינור הזה כספריית Amplicon המדולל (DAL) הצינור. וורטקס DAL ומסובב בקצרה microcentrifuge. דגירת DAL על 96 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. להפוך את צינור DAL 3 פעמים וקבעו DAL על קרח דק 5 לפחות, בעת ההכנה ברצף על רצף. לאחר 5 דקות, DAL הוא מוכן להיות טעון. אם סיימתי עם SGP, לאטום את הצלחת עם סרט נייר אלומיניום דבק ולתייג אותם למזהת תאריך צלחת. אחסן את SGP ו PAL חתום ב -15 ל- C ° -25. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> איור 3:. ספריית Prep QC ג'ל דוגמא הקו הירוק על הלהקות תחתונות כדי לציין את הסמן התחתון וקו הסגול על הלהקות העליונות הוא כדי לציין את הסמן הגבוה. הכל עבד טוב נתיבים H1, A2, B2, C2, E2, ו G2. כנת הספרייה לא לפעול באופן מיטבי עבור הנתיבים D2, F2, ו- H2, אבל תוצאות עדיין תושגנה הם פשוט לא יכולים להיות כיסוי הולם. לקבלת A3, הכנה הספרייה עבד בקושי וככל הנראה דגימת DNA זה לא היה מספיק עבור assay. הלהקות הנמוכות מעל הסמן התחתון הן פריימרים בשימוש, משום aliquot נלקח ישירות מן PCRed היטב. מדגם NTC צריך רק להקה פריימר ללא שימוש, ולא שום דבר אחר. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. רצף 5. הבטח SampleSheet.csv נכונה נעשתה עבור הריצה. ראה משלים איור 1 דוגמה. יש לשטוף ולייבש את תא הזרימה ולהוסיף 600 μl של DAL למחסנית המגיבה המופשרת. הכן ברצף עבור סידור ידי ביצוע ההנחיות המופיעות על המסך. 6. ניתוח נתונים הפעל את הצינור ביואינפורמטיקה. לנצל את in-house, צינור bioinformatic אישית מעוצבת לזהות מוטציות, הוספות, מחיקות amplifications 18. אחרי הצינור השלים, לבדוק את קבצי לוג עבור שגיאות / אזהרה, כמו כל טעויות משמעותיות / סיוע אזהרות ב QC של עיבוד הצינור. לנתח את הנתונים הסטטיסטיים בטווח (לוח 3) כדי להבטיח את ספריית הרצף עבר במעבדה נקבעה מדדי QC (איור 4). באופן ידני לבדוק כל חלופה על ידי הצגת קבצי .bam ב צופה נתונים הגנומי (למשל, וי ג'נומיקס אינטגרטיביתכד 16 (IGV)). הערה: רק גרסאות בטווח אלל בתדירות תוקף מעל עומק מינימלי של כיסוי לאחר סינון איכות מדווחות (באמצעות האגודה וריאציה הגנום האנושי (HGVS) המינוח). לדיווח סופי, כל גרסת exonic הייתה לסווג: פתוגניים, כנראה מחלה הקשורה, וריאנט של משמעות לא ידועה (VUS), סביר שפירה, ושפירים. כל הגירסות מעל קריטריוני הדיווח של תדירות אלל 5%, למעט תיחשבנה אלה הגירסות שפירות ושינויים נרדפים, דווחו. סקירת איור 4. בקרת איכות צעדי NGS. בקרת איכות של כל שלב בתהליך יש צורך להבטיח את הרצף יניב תוצאות באופן שיגרום לערכי רצף לפני ואחרי נחשבים. טיפול דגימה נאות השפעה מכריע על DNA באיכות גבוהה. דםמח עצם fixatives הולם יכול להניב DNA באיכות נמוכה. קיבעון לא ראוי של דגימות גידולים מוצקים יכול לבזות DNA (למשל, קיבעון B5). איכות DNA יש לבחון לחלבון וזיהום RNA באמצעות spectrophotometric, ומעריך במדויק את הסכום ואת שלמות ה- DNA. מדדי הרצף צריכים להיקבע באופן אמפירי במעבדת הרצף במעקב במשך כל תגובת רצף וכל דגימה. לפני הדיווח על תוצאות הרצף עבור כל דגימה יש לבחון עבור כיסוי, עומק, ביצועים נאותים של בקרות חיוביות ושליליות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Representative Results

מקרה 1 – הרן-NGS לוח הדנ"א מופק מדם היקפי leukemic היה באיכות מספקת וכמות (176 ng / μl) עבור לוח הרן-NGS. העומק הממוצע הכולל של סיקור היה 4,933x (מעל העומק המינימאלי הממוצע של סיקור 1,000x). סטטיסטיקת ריצה נוספת היא בטבלה 3. 8 האזורים בהמשך כיסוי 250x, 3 היו בשל זמירה התקינה של פריימרים (כלומר, רצף פריימר לא הוסר כראוי בגלל שגיאות רצף), 1 היה חפץ ידוע של assay, ושני 4 היו אזורים חלקיים של אקסונים של גנים שונים ללא גרסות דיווח. למרות הפרוטוקול הקליני שלנו כולל רק דיווח הגירסות המכוסות על ידי לפחות 250 קורא, את כל הנתונים עם לפחות 100 קורא מיובאים לתוך מסד הנתונים לבדיקה. f עיבוד נתוניםrom בצנרת ביואינפורמטיקה זוהתה שלוש מוטציות דיווח, הקשורים למחלה; מוטציה missense ב FLT3, מוטציה missense ב IDH2, ו מוטציה frameshift ב NPM1. וריאנטים exonic עם תדרי אלל שלהם מתוארים בטבלה 4. מוטציה נפוצה FLT3 היא שכפול טנדם -internal FLT3 (ITD) אשר אינו נקרא באופן אוטומטי על ידי הצינור שלנו דורשת בדיקה ויזואלית של בדיקה ויזואלית אקסון 14. של אקסון 14 של FLT3 לא הראה כניסה או כפילות הדגימה שהוגשה. FLT3 I836del היה בתדר 1% אלל ולא נכלל בדו"ח הסופי כי זה ירד מתחת תדירות אלל מינימום התוקף של 5%. מוטציה זו אינה באותו מולקולת הדנ"א כשינוי FLT3 D835Y (כלומר, נצפה באזור amplicon אותו, אבל לא "ציס" בכל רצף כניסות) וזה נצפה רק על ידי בדיקה ידנית של fi .bamles בעת בדיקת שינוי p.D835Y. התדרים אלל הנמוכים מבין שתי מוטציות FLT3 מרמזים מוטציות אלה עשויות לייצג ההטרוגניות ו / או התפתחות משובטת; עם זאת, ההבדל יכול להיות בגלל ביצועי assay עבור amplicon או פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP) ליד או חופף את רצף פריימר שהשפיע על ההגברה של אלל זה. תוצאות הלוח הרן-NGS עבור מקרה 1 עם זיהה מוטציות AML ב FLT3, IDH2, ו NPM1, שלושה גנים שעברו מוטציה נפוצה AML. מוטציות FLT3 נצפות ~ 25% של חולי מבוגרים הסובלים AML (מסד נתוני COSMIC 17) והם גם כפילויות טנדם פנימי (ITDS) או מוטציות missense בתחום טירוזין קינאז. FLT3-ITDS הן המוטציות השכיחות יותר ומזוהים עם תגובה ירודה לטיפול כימותרפי סטנדרטי, בעוד המשמעות הפרוגנוסטית של ד קינאז FLT3מוטציות נקודתיות omain, כפי שניתן לראות מטופל AML זה, יש השפעה ברורה על הפרוגנוזה 14. Isocitrate דהידרוגנז 2 (NADP +), המיטוכונדריה (IDH2) היא גן מקודד צירוף אפיגנטיים כי עובר מוטציה נפוצה AML. מוטציות מכפילי אפיגנטיים הן יחסית נפוצות AML, עם מוטציות IDH1 ו DNMT3A המייצגות מוטציות אחרות בכיתה זה של גנים להוביל חוסר ויסות גן. מוטציות בגן עבור nucleophosmin (NPM1) הן אחד מוטציות רכש הנפוצות ביותר AML ו נחשבות בדרך כלל להיות גורם מנבא טוב (בהעדר של FLT3 – ITD). Co-מוטציות של NPM1 ואת IDH2 תוארו בספרות כאינדיקטור פרוגנוסטי חיובי 5, עם הישרדות כוללת 3 שנים של 89%. זה מייצג יתרון הישרדותי משמעותי בהשוואה הישרדות 3 שנים הכוללת שלסוג בר NPM1 ו IDH2 31%. לדוגמה, סטנדרטי של תרגול הטיפול כולל ניתוח מוטציה עבור NPM 1 ומוטציות FLT3-ITD. בתרחיש זה, זיהוי של רק מוטצית NPM1 ייכשל למטופל לרבד כראוי עבור סיכון, כמו המוטציות משני יכולות להיות חיוביות (למשל, IDH2) או שלילי (למשל, TET2), צמצום ביטחון להקלת השתלת מח עצם. מקרה 2 – Solid-NGS לוח DNA שחולצו מן הרקמה FFPE היה באיכות ובכמות מספקת לוח מוצק NGS, עם ריכוז של 252 ng / μl ורק 4% של ה- DNA מתחת 1,000 זוגות בסיסים (bp). לאחר ניתוח נתונים לעומק הממוצע של סיקור היה 9167 קורא (הרבה מעל סף עומק המינימום שלנו של 1,000 כניסות) ללא אזורים בהמשך העומק לקרוא 250. מדדי QC נוספים הם shown בטבלה 3. עיבודי דרך צינור ביואינפורמטיקה מזוהה שתי מוטציות הקשורות למחלה: ההכנסה בתוך מסגרת ב אקסון 20 של ERBB2 (HER2 / neu) ו מוטציה missense ב TP53. כל גרסאות exonic עם תדרים אלל שלהם מיוצגים בלוח 5. ההחדרה ב ERBB2 למעשה מייצג טנדם כפולות (HER2 / neu) רצף, כפי שהיא משתקפת המינוח. זיהוי ואישור של בתוך המסגרת נדרשה כניסת הבדיקה הידנית של הרצף קוראים דרך IGV. הגילוי של תדרי מוטציה של יותר מ -50%, כפי שניתן לראות הן TP53 ואת Her2 / neu מוטציות הוא מרמז על אובדן הטרוזיגוטיות (LOH) אירוע (ראה דיון). תוצאות הלוח המוצקות NGS עבור מקרה 2 עם מוטציות זוהו אדנוקרצינומה ריאות in ERBB2 (HER2 / neu) ו TP53, שני גנים לא נבדקו כלל עבור כחלק סטנדרטי של הטיפול הנוכחי לחולי סרטן הריאות. HER2 / neu מקודד קולטן טירוזין קינאז דומה למשנו גן שעבר מוטציה נפוצה סרטן הריאות, EGFR . הפעלת HER2 / neu אקסון 20 הוספות הם נצפו 2 – 4% של אדנוקרצינומה ריאות, להסביר את רוב המוטציות HER2 / neu שנצפתה בסרטן הריאות, והם בדרך כלל לראות גידולים ללא מוטציות בגנים הנהג השני כמו EGFR ו ALK 12 . ישנם מספר קווים של פוטנציאל מראה ראיות אפשרויות הטיפול השונות עבור חולים עם הפעלת הוספות HER2 / neu, כולל תגובה חלקית לטיפול בשילוב עם HER2 / neu ומעכבי mTOR 13 ובקרת מחלה משמעותית עם נוגדנים חד שבטיים הרצפטין בשילוב עם כימותרפיה 15. גילוי שינוי TP53 אינו uncommon בסרטן, אך בשלב זה אין טיפולים לפעול על פיו. מקרה 1 מקרה 2 המוצא סה"כ קורא 2,215,926 2,129,110 אחוז קורא מיפוי 98.42% 98.29% אחוז קורא על היעד 99.01% 97.29% אחוז קורא על היעד לאחר סינון 97.60% 95.45% אחוז שמיש קורא 94.87% 91.79% אחוז הבסיסים מעל כיסוי 250x 98.40% 100% אחוז של בסיסיםסיקור 1000x בוב 95.90% 99.70% סיקור להלן 250x – Amplicon מספר 8 0 טבלה 3:. רצף הפעלת QC מדדים זהו סיכום של הנתונים הסטטיסטיים בטווח החשוב ביותר, לא כוללים כיסוי הממוצע, המשמשים לבדיקת נתונים כדי לקבוע אם מדגם כנת ספרייה עבר QC. התהליך כולו הוא מוצלח אם כל האחוזים הם מעל 90%, אבל זה אפשרי, עם שריד של SW1 או UB1 בשלב כביסת FPU או צולב לדבר פריימר, שיהיו נמוכים 'באחוזי היעד' בטווח של 80 – 90%. אם 'באחוזים הממופים' הוא נמוכים מדי, דבר המצביע על זיהום של חיידקים או DNA האחר, כמו כל הדגימות צריכות ליישר אדם. כאשר כל המפרטים הללו הם מתחת ל -80%, המדגם הוא מסומן לבדיקה נוספת כדי לקבוע כיצד proceed ולשפר את התהליך. לוח 4:.. מקרה 1 תוצאות זוהו פתוגניים, מחלות הקשורות, וריאנט של משמעות לא ידועה (VUS), וגרסות exonic שפיר סביר מעל קריטריוני הדיווח של תדירות אלל 5% מפורטים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה. לוח 5:.. מקרה 2 תוצאות זוהה פתוגניים, מחלות הקשורות, וריאנט של משמעות לא ידוע (VUS), וגירסאות exonic שפיר סביר מעל הקריטריונים הדיווח של תדירות אלל 5% מפורטים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה. משלימת איור 1: דוגמא SampleSheet.csv amplicon המבוסס. גיליון זה מעביר ברצף מה כימיה לרוץ (במקרה זה Amplicon), מה העבודה (למשל, GenerateFastq), מה יישומים Assay (למשל, FastqOnly), כמה בסיסים (או קורא) כדי רצף (ב BP במקרה 186 זה x 186 נ"ב), ולבסוף מה דגימות המשויכים אינדקסים מסוימים (ב אינדוקס כפול במקרה זה). החלקים מסומנים בצהוב ניתן לשנות את מה הנסיין רוצה, אבל במקרה הזה במעבדה נעשה שימוש בפרמטרים אלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

Discussion

כמו שתי בדיקות NGS המתוארות בכתב היד הזה מוצעות קליני, השיקול המעשי החשוב ביותר הוא בקרת איכות. באופן ספציפי, שיקול קרוב חייב להיות משולם על האיכות והכמות של ה- DNA חילוץ. זה חשוב במיוחד עבור דגימות FFPE אשר לעתים נשחק עם תשואה DNA משתנה. שיטה משקעת isopropanol פותחה על מנת למקסם את תשואת דנ"א מדגימה FFPE כשיטות מבוססות עמודה נמצאו לפעמים להוביל גז DNA עם כרכי elution מוגבלים. לכן, רוב הזמן כאשר דגימת מניב ריכוז נמוך מדי או נפגעת מדי עבור assay, זה ככל הנראה בשל גודל הרקמה, סוג, או קיבעון ולא תהליך החילוץ. לקבלת דגימות מח דם / העצם, אם יש כישלון החילוץ, זה בדרך כלל עקב hemodilute להיות המדגם (כלומר, לא שיש מספר מספיק של תאי דם או גידול לבן כי תיקו) או הכימותרפיה ablated.

. NT "> במהלך אימות, הפסקות עבור קבילות של איכות DNA וכמות יש להקי הקלט המומלץ של 100 – 250 ng משמש לעתים קרובות ב assay, אולם, אם איכות ה- DNA היא טובה, אז כמויות קלט נמוכות יכולות להצליח. בנוסף, אם איכות ה- DNA היא עניה (כלומר, את כמות ה- DNA amplifiable היא פחות מ -100 – 250 ng) אז כמויות תשומות גבוהות יכולות לשפר את איכות תוצאות הרצף (מאז את כמות ה- DNA amplifiable תגיע הקלט המומלץ) המדדים. עבור איכות DNA וכמות צריכים להיות מוחלים על כל דגימה לפני קידום ה- DNA לתוך כנת ספרייה. דגימות קשיש המתגורר "שטח אפור" (ראה איור 2) יש להפעיל על פי שיקול דעתו של מנהל המעבדה או מי שהוסמך. נכון לעכשיו את הטוב ביותר דרך לנבא אם ה- DNA לא לתפקד היטב במהלך הרצף הוא לבצע assay מבוסס qPCR המאפשר הערכת וכימות ואיכות DNA קלט. גישה זו מתייחסת bioavailability של שברים בגדלים שונים הדגימה, דרך ההגברה של שברים בגדלים שונים (למשל, 100 נ"ב, 150 נ"ב, 200 נ"ב ו -300 נ"ב) והשוואת תשואה.

נכון לעכשיו, הכנה הספרייה כוללת מספר רב של פעולות באופן ידני שבו צעד מוטעה באחד הצמתים כמה יכול לגרום לספרייה או להיכשל או להיות באיכות ירודה. ניתוח ג'ל microfluidic הוא צעד QC רק כדי לבדוק סוגיה כנה ספרייה לפני הרצף. בהתאם לכך, ישנם מספר צעדים קריטיים שבם mindfulness נוסף יכול להגדיל את הסבירות של תגובה מוצלחת. זה הכרחי כדי להבטיח את המדגם הנכון ובריכת oligonucleotide משמשים עבור כל דגימה. הבטחתי כראוי הקלטה שכל מדגם מכיל אחד 96 שילובים ייחודיים של זוגות פריימר PCR כפולים באינדקס מפחית סיכוי בלבול מדגם. כמו כן, חשוב להבטיח את צלחת המסנן (FPU) מנקזת כראוי; אם זה לא לנקז כראוי זה יכול לגרום exteצעד nsion-קשירה של כנת הספרייה לבצע תת-אופטימלית ולהוביל נתונים רצף באיכות ירודה. לאחר הספרייה QC, זה קריטי על מנת להבטיח כי חרוזים LNB1 הם resuspended מלא ושהפתרון LNB1 / LNA1 מעורבב היטב לפני הוספתו דגימות כמו ריכוז של תערובת זו משמשת כדי לקבוע את molarity של הספרייה. לבסוף, אם צעד elution החרוז מוביל כמות לא טובה של ספרייה משחרר את החרוזים היא תקטין צפיפות אשכולות ועלול לגרום לתקלת הספרייה לא להשיג כיסוי ממוצע נאות. לעומת זאת, עודף של ספרייה יוביל באיכות ירודה קוראת. לכן, חשוב להיות עקבי על צעד הנורמליזציה מבוסס חרוז על מנת להבטיח איגום אופטימלי אשכולות של הספריות על ברצף.

בנוסף הכנת ספרייה, הוא קריטי כדי לאמת צינור ביואינפורמטיקה שיפיק שיחות מוטציה מדויקות מקובצי fastq הגלם, דה-מרובב. בחירתפתרון מותאם אישית יכול להיות זמן רב כפי שיש aligners רב הקוד פתוח, זמין מסחרי, המתקשרות וריאנט, וחבילות תוכנת NGS שאחד יצטרך לנפות. אלגוריתמים אישית יהיה צורך שנועד לחלץ נתונים סטטיסטיים של ביצועים חיוניים, לזהות מוטציות חוזרות ייחודי שהצליחו לחמוק כלי קוד פתוח ביותר, ולקבוע מעמד מספר עותק על כל אחת לוקוסים. במהלך תהליך האימות של צינור ביואינפורמטיקה, חשוב לקבוע את הפסקות דיווח עבור גרסאות שעומדות או יעלה גם עומק מינימלי של כיסוי לאחר סינון איכות (למשל, מינימום של 250 כניסות) ואת תדירות אלל מינימום (למשל, 4 %). מאז זה assay amplicon המבוסס מרובב, חשוב לקבוע את המינימום אומר עומק הכיסוי (למשל, 1,000x) שהספרייה צריכה להשיג כדי להיות מסוגל לקבל את amplicon ביצוע הנמוך ביותר אל העומק המינימאלי של הקורא. בנוסף, האופי מרובב של assay עושה גause את השפעות יעד ואלה 'חפצים' יצטרך להתגלות בדקה במלואו לפני ההשקה. מגבלה חשובה נוספת אל assay תיאר צורך דגימות להכיל יותר מ -10% גידול על מנת להשיג את תדירות האלל מינימום תוקף.

הגילוי של תדירות נמוכה, 1%, הוספות FLT3 ראיות לכך בדיקה ידנית עדיין רצוי בתהליך זה. אפילו עם חתך תדירות אלל של 5%, מוטציות חשובות אולי החמיצו ולכן בדיקה ידנית תהיה חיונית לברר הגירסות אלה. עבור FLT3-ITDS, בדיקה ויזואלית של אקסון 14 מבוצעת עבור כל חולי AML כדי להבטיח רמה נמוכה או שכפול / כניסה גדולה לא נעלם מעיניו. בנוסף, הוספות 20 אקסון HER2 סמוכים נפוץ רצף פריימר, צריכות התערבות ידנית. למרות שיש צינור ביואינפורמטיקה חזק, כמה הגירסות יכולות שלא להתעלם וזה רק האופי שיש קיצוץ קשהאת רוב הנתונים הסטטיסטיים הנ"ל. ביואינפורמטיקה העדיפה תהיה צורך לעזור להקל על בעיה זו, כמו גם כן ספרייה טובה יותר ו / או מתודולוגיות רצף, כי זה יותר יתרון יש נתונים באיכות טובות אפילו הפסקות נמוכות המכילות חפצים פחות חיוביות שגוי.

הגילוי והפרשנות של תדרי אלל יכולים להיות קשים בשל הקושי בקביעת אחוז גידול הטית הגברה של אזורים מסוימים של הגנום. בנוסף, תדרי אלל מ -50% ניתן לאתר, כפי שנצפו במקרה 2. זה מתפרש אובדן הטרוזיגוטיות (LOH) אירוע, בין אם עקב אובדן של אלל הנורמלי, שהביא לגידול הניכר של מוטציה קוראת, רווח של אלל מוטנטי (למשל, מוטציה 2 והעתק אחד רגיל) או מנגנונים אחרים. מנגנונים אלה יכולים להיות מוסברים על ידי ניצול הכלאה גנומית השוואתי מערך (aCGH ¹⁹⁾ ו / או מערך גנוטיפ SNP. ^20.

מתודולוגיות עשרת היעד הנוכחיות להסתמך על נהלי יום שלם של לכידה היברידית או לא יעילה או טכניקות PCR מרובבות שתוצאתן את הצורך בכיסוי רצף יותר מדגם אחד ועוד את רצף היעד ייקרא. יישומים נוספים בתחום האונקולוגיה מולקולרית NGS הצפוי בעתיד הקרוב יכללו שיטות כנות ספרייה קלות שיכול להיות automatable מלא ולהיות מסוגל לעבד דגימות עם סכומים נמוכים מאוד של DNA קלט (כלומר, פחות מ -1 ng) כמו גם דגימות עם מושפל מאוד DNA. כדי לטפל באתגרים אלה, רוב השיטות הנראה תהיינה מבוססות PCR, או להיות גישת PCR רב שלבים או גישת PCR singleplex מקבילה מסיבי. בנוסף, barcoding המולקולרי של amplicons הפרט הוכח להפחית את רעש רצף רקע דראמטי ויאפשר בדיקות של דגימות עם פרופורציות נמוכות יותר של תאים סרטניים להשיג תדרי אלל נמוכים ולנוע לעבר לכידת circulating תאים סרטניים.

איתור של מוטציות הקשורים למחלות בדגימות סרטן כבר רמת הטיפול במשך עשרות שנים. מבחינה היסטורית, גנים לעתים קרובות נבדקו ברצף, גן אחד / אקסון בכל פעם, עם זיהוי מוטציה שמוביל בסופו של רצף הבדיקה. הופעתו של NGS אפשרה גישה מוטה פחות להרצפת מספר רב של גנים הקשורים סרטן רב במקביל מוביל לזיהוי מוטציות רבות המשויכים neoplasia. על התועלת הקלינית של NGS לצורך זיהוי של מוטציות סומטיות בסרטן היא ברורה יותר ויותר. ואכן, NGS מבוסס ניתוח של דגימות גידול מייצג פרדיגמה חדשה שקוראים תיגר מסורתי, בדיקות גן יחידות, אלא על התועלת הקלינית היא מאוד ברורה. מעבדות קליניות יש היום ההזדמנות המרגשת להינשא אימות שיטה זהירה פרשנות מבחן עם היישום של טכנולוגיה רבה עצמה זו.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות בסיוע דניאל Wild לקריאה של כתב היד וסיוע לייצור.

Materials

Genomic DNA ScreenTape	Agilent Technology	5067-5365
Genomic DNA Reagents	Agilent Technology	5067-5366
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technology	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technology	5067-5585
TapeStation 2200	Agilent Technology	G2965A
TapeStation Analysis Software	Agilent Technology	A.01.04 or higher
96-well Tube Storage Racks	Any Vendor
15/50 ml Tube Rack	Any Vendor
96-well Plate Rack	Any Vendor
Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μL	Any Vendor
Pipette, single-channel, 1–10 μL	Any Vendor
Pipette, single-channel, 2–20 μL	Any Vendor
Pipette, single-channel, 10–100 μL	Any Vendor
Pipette, single-channel, 20–200 μL	Any Vendor
Pipette, single-channel, 100–1000 μL	Any Vendor
Serological Pipettor	Any Vendor
Vortexer	Any Vendor
Ice bucket	Any Vendor
Microcentrifuge (for tubes and strip tubes)	Any Vendor
Freezer, -20 °C	Any Vendor
4 °C Refrigerator	Any Vendor
Water or Bead Bath	Any Vendor
Incubator (37 ^oC)	Any Vendor
Serological Pipettes, 1 mL	Any Vendor
Serological Pipettes, 5 mL	Any Vendor
Serological Pipettes, 10 mL	Any Vendor
Serological Pipettes, 25 mL	Any Vendor
Gloves	Any Vendor
Razor Blades/Scaples	Any Vendor
KimWipes	Any Vendor
15 mL Conical Tube	Any Vendor
50 mL Conical Tube	Any Vendor
Paper Towels	Any Vendor
200 proof Ethanol	Any Vendor		Store in Flammable Cabinet
2-Propanol (Isopropanol)	Any Vendor		Store in Flammable Cabinet
25ml Reservoirs	Any Vendor
10N NaOH	Any Vendor
Pipette, 8-channel, 1–10 μL	Any Vendor
Pipette, 8-channel, 10–100 μL	Any Vendor
Pipette, 8-channel, 20–300 μL	Any Vendor
Ice Bucket	Any Vendor
Water Squirt Bottle	Any Vendor
Alcohol Squirt Bottle	Any Vendor
Lens Cleaning Paper	Any Vendor
Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted	Any Vendor
Tube strips, 8-well, 0.2 mL	Any Vendor
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
BioShake IQ or 3000-T elm	Bulldog Bio/Q.Instruments	1808-0506/ 1808-0517
DropPlate96 S – LabChipDS	Caliper	128876
DropPlate96 D – LabChipDS	Caliper	132848
DropSense96	Caliper (Trinean)
DropQuant Software	Caliper (Trinean)
Plate Sealing Film	Denville	B1212-5S
Aluminum Seal Foil	Denville	B1212-6S
Nuclease-Free, Pure Water System	EMD Millipore
5424 centrifuge	Eppendorf	22621408
5804R centrifuge	Eppendorf	22623508	Both 15 ml tube and plate rotators, preferably a centrifuge that can go up to 2,500 x g.
Safe-Lock Tube 1.5 mL, Natural	Eppendorf	22431021
5 mL Tube, DNA LoBind Tube	Eppendorf	30108310
5430R Centrifuge	Eppendorf	022620645	Any plate rotator centrifuge will work
Hybex Microsample Incubator	Fisher Scientific	1057-30-0
Hybex 0.2 mL Tube Block	Fisher Scientific	1057-31-0
TruSeq Amplicon – Cancer Panel	Illumina	FC-130-1008	96 reactions
TruSeq Custom Amplicon	Illumina	PE-940-1011	96 reactions
TruSeq Custom Amplicon Index Kit	Illumina	FC-130-1003	96 Indices, 384 Samples
MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles	Illumina	MS-102-2002
MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles	Illumina	MS-102-2003
Experiment Manager	Illumina	1.3 or higher
MiSeq Reporter	Illumina	2.0 or higher
Sequencing Analysis Viewer	Illumina	1.8 or higher
TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit	Illumina	FC-130-1007
MiSeq v2	Illumina	SY-410-1003
TruSeq Custom Amplicon Filter Plate	Illumina	FC-130-1006
Index Adapter Replacement Caps	Illumina	11294657
Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit 0.5 ml Tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit	Invitrogen	Q32853
DynaMa6-96 Magnetic Stand, Side Skirted	Invitrogen	120.27
GeneAmp PCR System 9700 (gold/silver block)	Life Technologies	N8050200
Gentra Puregene Blood Kit	Qiagen	158489
Deparaffinization Solution (16ml)	Qiagen	19093
Buffer ATL (4x50ml)	Qiagen	939011
Protein Precipitation Solution (50 ml)	Qiagen	158910
DNA Hydration Solution (100ml)	Qiagen	158914
Glycogen Solution (500 μl)	Qiagen	158930
Qiagen Proteinase K	Qiagen	19133
Rnase (5ml)	Qiagen	158924
Nuclease-Free Water (10 x 50 ml)	Qiagen	129114
Pestles	USA Scientific	1415-5390
TipOne RPT 10 ul elongated filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips).	USA Scientific	1180-3810
TipOne RPT 100 ul natural, beveled filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips)	USA Scientific	1180-1840
TipOne RPT 200 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips)	USA Scientific	1180-8810
TipOne RPT 20 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips)	USA Scientific	1180-1810
TipOne RPT 1000 μl natural, graduated XL filter pipet tips in	USA Scientific	1182-1830

References

Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
Campbell, P. J., et al. The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).
Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).
Frampton, G. M., et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).
Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).
Forbes, S. A., et al. COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).
Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies. Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).
Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults – biological significance and clinical use. Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).
Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. Molecular genetics in acute myeloid leukemia. Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).
Subramanian, J., Govindan, R. Lung cancer in "Never-smokers": a unique entity. Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).
Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma. Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).
Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).
Gandhi, L., et al. Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors. J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).
Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients. Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).
Mazières, J., et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).
Robinson, J. T., et al. Integrative Genomics Viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).
Forbes, S. A., et al. COSMIC: exploring the world’s knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).
Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets. Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).
Haraksingh, R. R., et al. Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms. PLoS ONE. 6 (11), e27859 (2011).
de Leeuw, N., et al. SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics – Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control. Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Fox, A. J., Hiemenz, M. C., Lieberman, D. B., Sukhadia, S., Li, B., Grubb, J., Candrea, P., Ganapathy, K., Zhao, J., Roth, D., Alley, E., Loren, A., Morrissette, J. J. D. Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors. J. Vis. Exp. (115), e52758, doi:10.3791/52758 (2016).

Automatically Generated