Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

Este protocolo comprende las etapas más destacadas de dos pruebas de laboratorio desarrollado validados para el perfil genómico de tumores sólidos y líquidos, respectivamente. Las pruebas realizadas en el laboratorio se realiza de acuerdo con los requisitos de las Enmiendas de Mejoras de Laboratorio Clínico (CLIA) de 1988. 1. Extracción de ADN a partir de sangre periférica o de médula ósea Determinar la cantidad de sangre o de médula ósea para tomar en función de la Tabla 1. Muestra / CMB La cantidad a ser tratada como 1 ml de sangre Médula ósea 250 l Sangre WBC 12.000 – 50.000 1 ml Sangre WBC 50.000 – 100.000 500 l WBC de sangre 100.000 – 200.000 200 l </ Td> Sangre WBC> 200.000 100 l * Para la sangre WBC <12.000, tomar 2 ml de sangre Tabla 1:. / Médula Ósea volumen de sangre que use la tabla Puesto que el recuento de glóbulos blancos puede variar de una muestra a otra, es difícil especificar un volumen específico de sangre para su uso. Por lo tanto, la cantidad de sangre a usar para el ensayo debe ser determinada observando el recuento de glóbulos blancos (WBC) antes de empezar el ensayo. Aunque se utiliza menos sangre, todavía debe ser tratado como si sus 1 ml ya que el volumen de sangre que se utiliza se reduce debido a que el número de células presentes es mayor de lo normal. Siga el protocolo del kit disponible comercialmente para aislar el ADN genómico. 2. Extracción de ADN de tejido incluidas en parafina (FFPE) fijado en formalina Residencia enla región del tumor el patólogo con un círculo en la diapositiva H & E, se alinean las diapositivas no teñidas con la guía de H & E diapositivas y delinear un área similar para su extracción. Por macro-disección, proceso de un solo espécimen / set del paciente de diapositivas a la vez. Se calientan los portas en un bloque de calor a 45 ° C para fundir la parafina ligeramente. Raspe con cuidado el tejido dentro de las líneas que se marcan en la diapositiva, utilizando un bisturí nueva para cada muestra a extraer. Coloque los raspados de cera en el tubo debidamente etiquetado 1,5 ml. Tenga cuidado porque la cera es muy raspada electrostática y puede saltar fuera del tubo. Añadir 320 l de solución de desparafinación para cada cinco a seis 5 micras secciones (25 – 30 micras en total). Por ejemplo, si un tubo que contiene 3 secciones de un 10 micras rollo / enrollamiento se va a procesar, a continuación, utilizar 320 l, pero si se obtuvieron 5 secciones en el mismo espesor a continuación, utilizar 640 l. Agitar vigorosamente durante al menos 10 segundos y realizar aqgiro uick en una microcentrífuga para extirpar el tejido / cera de los lados y la tapa y en la solución. Incubar a 56 ° C durante 3 min, y luego se incuba a temperatura ambiente durante 5 -. 10 min. Después de la incubación RT, añadir 180 l de tampón ATL por cada 320 l de solución de desparafinación añadido. Picar el tejido diez veces usando un mini-mano de mortero estéril usando una nueva mano de mortero para cada espécimen. Asegúrese de que no hay tejido pegado a la mano del mortero, ya que puede ser muy pegajosa. Vortex vigorosamente la suspensión durante 3 segundos y centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto. Añadir 10 l de proteinasa K a la fase clara inferior. Mezclar suavemente pipeteando arriba y hacia abajo para asegurar que se volvió a suspender el tejido. NO hacer vórtice. Incubar a 56 ° C durante la noche con agitación a 400-500 rpm. A la mañana siguiente, compruebe si el tejido se haya disuelto completamente (esto ha ocurrido si la solución es clara inferior). Si la solución inferior no está claro, a continuación, agitar vigorosamente durante 3 segundos y centrifugar a máxima velocidad for 1 min. Añadir un extra de 5 – 10 l de proteinasa K y se incuba a 56 ° C durante 30 – 60 min. Se incuba a 90 ° C durante 1 hora para ayudar a revertir el formaldehído entrecruzamiento. Dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante 5 – 10 minutos a centrifugar brevemente y luego cada tubo para consolidar el líquido. Pasar la fase clara inferior en un tubo etiquetado 1,5 ml. Si hay varios tubos de la misma muestra de pacientes (por ejemplo, el caso si se utilizan múltiples rollos), recombinar las fases inferiores en un tubo en este punto. Nota: La transferencia de pequeñas cantidades de la solución de desparafinación no debe interferir con el procedimiento de purificación, pero existe un riesgo si una gran cantidad se transfiere. Añadir 2 l de solución de RNasa A. Vórtice suavemente o invierte 25 veces y vuelta rápida en una microcentrífuga. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 200 l de solución de proteína Precipitación. Si al hacer una o dos rollos, utilizar 200 l. Si hace tres rodilloss de una vez, a continuación, utilizar 400 l. Vortex vigorosamente a alta velocidad durante 30 segundos para mezclar uniformemente los tampones de lisis. Incubar en hielo durante 5 min o las muestras pueden permanecer en el hielo durante un máximo de una hora. Se centrifuga a 5.000 g durante 5 min. La proteína precipitada debe formar un apretado, sedimento blanco. Verter el sobrenadante en un tubo etiquetado 1,5 ml, y a continuación incubar las muestras en hielo durante al menos 3 min. Se centrifuga a 5.000 g durante 3 min. Añadir 200 l de 2-propanol (isopropanol) para cada 180 l de tampón ATL añaden antes a un tubo etiquetado 1,5 ml (que podría ser necesario el uso de un tubo de 2 ml). Por ejemplo, si al hacerlo tres rollos añaden 600 l de isopropanol. Añadir 1 l de glucógeno por cada 180 l de tampón ATL añadido anteriormente a la isopropanol e invertir el tubo varias veces para mezclar. añadir con cuidado el sobrenadante de la etapa de precipitación de la proteína en la mezcla de isopropanol. Mezclar el tubo invirtiendo suavemente al menos 50 veces. Centrifugar a máxima spEED durante 3 min. El ADN será visible tan pequeño sedimento blanco en la parte inferior del tubo. Vierta o aspirar el sobrenadante en el tubo de recuperación apropiado. Mantenga un tubo de 1,5 ml de residuos por separado para cada muestra en caso de que el pellet viene desalojado por lo que no se perderá o se mezcla con los residuos de otros especímenes. Escurrir el tubo sobre una toalla de papel y compruebe se elimina la mayor parte del isopropanol. Añadir 300 l de etanol recién hecho 70%. Invertir el tubo suavemente varias veces para lavar el sedimento. Tratar de asegurar la pastilla viene desalojada para asegurar una limpieza más profunda. Centrifugar a velocidad máxima durante 5 min. y luego retirar con cuidado el etanol. El sedimento puede estar suelto, por lo que vierta o aspirado lentamente y ver el sedimento. Eliminar el exceso de etanol a partir de la parte interior del tubo, sin tocar el pellet. Permitir que las muestras se sequen al aire durante 5 – 15 min, teniendo cuidado de no sobre secar la muestra. Añadir entre 25 – 100 l de solución de hidratación de ADN al correomuestra ACH basado en el tamaño del sedimento de ADN y la cantidad a partir de tejido. Vortex los tubos vigorosamente y girar brevemente en una microcentrífuga. Incubar durante 1 hora a 65 ° C para rehidratar completamente el ADN. 3. Control de Calidad de ADN genómico Nota: Hay tres pasos independientes para el control de la calidad del ADN (QC). Véase la Tabla 2 para mayor explicación de por qué se lleva a cabo cada paso del control de calidad. Instrumento Resultado Indicación Rango Ideal DropSense96 A260 / A230 Identificación de contaminantes químicos (por ejemplo, etanol) 1.50 – 2.2 DropSense96 A260 / A280 Identificación de contaminantes proteicos 1.60 – 2.2 DropSense96 Concentración la cuantificación de ADN > 1 ng / l TapeStation ADN Smear Determinación de la integridad del ADN (por ejemplo, la degradación / fragmentación de ADN extraído) 50%> 1.000 pb 2.0 qubit Concentración Más precisa cuantificación de ADN > 1 ng / l Tabla 2:. QC ADN Resultados esperados Todos estos valores se tienen en cuenta antes de ejecutar una muestra que permite proceder a la etapa de preparación de la biblioteca. Siguiendo el protocolo del fabricante, ejecute 2 l de ADN extraído en un fluorómetro para obtener la concentración de trabajo (ng / l) de la muestra. Ejecutar 1 – 2 l de cada muestra en un espectrofotómetro UV / VIS para comprobar la calidad de la muestra (A260 / A230 y A260 rata / A280ios) según las instrucciones del fabricante. Para las muestras FFPE: Siguiendo las instrucciones del fabricante, ejecutar 1 l de cada muestra en un sistema de electroforesis en gel de microfluidos para evaluar la degradación / fragmentación del ADN. Vea la Figura 2 para ver ejemplos. Figura 2:. El ADN genómico del control de calidad del gel Ejemplo La línea verde sobre las bandas más bajas es indicar el marcador más bajo. La línea roja añadido-in es para indicar aproximadamente 1.000 pb. Carril A2 representa el ADN intacto, como uno esperaría de Sue tis fresco (por ejemplo, sangre periférica o médula ósea). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 son ejemplos de buenas FFPE de ADN, intacta. El ADN en F2 carril parece estar intacta, pero en una concentración demasiado baja. El ADN en G2 carril es degradada o fragmentada y no funcionará en el ensayo. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 representan ADN que cae dentro de la "zona gris" lo que significa que el ensayo puede funcionar bien, pero algunos de los ADN podría ser demasiado dañado o reticulado y por lo tanto no va a funcionar bien en el ensayo. Haga clic aquí para ver una más grande versión de esta figura. 4. Preparación de amplicones Biblioteca La hibridación de oligo-piscina y Extensión La ligadura de oligos Bound En la sala de Pre-PCR, añadir el volumen necesario de bajo EDTA TE, 5 l de tubo Oligo del Panel (por ejemplo, Solid-NGS Panel o hemo-NGS Panel), y 100 a 250 ng de ADN genómico de cada uno correspondiente bien en una placa de 96 pocillos semi-bordeado etiquetado como la placa de hibridación (HYB). Añadir 40 l de oligo hibridación para la secuenciación del reactivo 1 (OHS1) a cada muestra en la placa HYB. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 5 – 6 veces para mezclar. Cambie las puntas después de cada columna para evitar quecontaminación cruzada. Sellar la placa con papel de aluminio HYB adhesivo y centrifugar a 1000 xg durante 30 seg. Incubar la placa HYB en la incubadora de hibridación precalentado a 95 ° C durante 1 min. Ajuste la temperatura de la incubadora de hibridación a 40 ° C. Continuar la incubación el tiempo que se tarda la incubadora a disminuir desde 95 ° C a 40 ° C (~ 90 min). Nota: Este enfriamiento gradual es crítica para la hibridación adecuada. Durante el último 15 – 20 min de incubación de la hibridación, lavado previo de la unidad de placa de filtro (FPU). Prepare sólo los pocillos para ser utilizados en el ensayo actual, es decir, sólo utilice pozos frescos / no utilizadas de una placa de filtro previamente abierta, pero nunca volver a utilizar los pozos que se han utilizado. Nota: Esto debe ser clara basada en el número de juego en la placa de filtro, las marcas de la placa de filtro, y el sellador utilizado en toda la placa. Usando una pipeta multicanal, añadir 45 l de lavado astringente 1 (SW1) a cada pocillo. <br /> PRECAUCIÓN: Contiene formamida. Cubierta y centrifugar la FPU a 2.250 xg durante 3 min a 20 ° C. Compruebe cada bien para líquido residual (> 15 l / pocillo). Si existe líquido residual, girar el ° FPU 180 y repetir el paso de centrifugación de nuevo para una 3 min adicionales. Si el líquido residual hace girar a través de la segunda vez, a continuación, proceder al siguiente paso, si no, entonces puede haber un defecto en la placa de filtro y tendrá que ser reemplazado la placa actual. Una vez que la incubadora de hibridación se ha enfriado a 40 ° C, se centrifuga la placa a 1000 xg durante al menos 30 segundos a 20 ° C para recoger la condensación. Transferir todo el volumen de cada muestra de la placa de HYB sobre el centro de los pocillos correspondientes prelavada de la FPU. Cambiar las puntas después de cada columna para evitar la contaminación cruzada. Cubrir la FPU y se centrifuga a 2.250 g durante 3 min a 20 ° C. Añadir 45 l de SW1 y centrifugar a 2250 xg durante 3 min a 20 ° C. Repita para un total de dos lavados. Gire el FPU 180 ° y se centrifuga de nuevo a 2.250 xg durante 3 minutos para eliminar por completo todo el SW1. Disimular la FPU. Desechar todo el flujo a través (que contiene formamida) en el contenedor de residuos adecuado. Volver a montar la FPU utilizando una placa de recolección de residuos MIDI diferente. Añadir 45 l de tampón universal 1 (UB1) a cada pocillo de muestra y se centrifuga a 2250 xg durante 3 min a 20 ° C. PRECAUCIÓN: Contiene formamida. Añadir 45 l de Extensión ligadura Mix 3 (ELM3) a cada pocillo de muestra en la placa de FPU y la pipeta hacia arriba y abajo 3 veces para mezclar. Nota: La reacción de extensión-ligación se lleva a cabo en la membrana de placa filtrante. Sellar la placa con papel de aluminio FPU adhesivo y se incuba el conjunto completo FPU en un pre-calienta 37 ° C incubadora durante 45 min. La indexación y la amplificación por PCR Alícuota de los índices que se utilizan en los pocillos correspondientes en el indexado de amplificación Plcomió (IAP) disponiendo los cebadores en el Aparato índice de placa, dispuestos de la siguiente manera: Tubos de cebadores i5 (gorras blancas, solución clara) verticalmente, alineados con las filas A a H, tubos de cebadores i7 (tapas naranjas, solución amarilla) horizontalmente , alineados con las columnas 1 a 12. el uso de un p10 pipeta multicanal, añadir 4 l de cebadores i7 (solución amarilla) a cada fila de la IAP y añadir 4 l de cebadores i5 (solución clara) a cada columna de la IAP. En el hielo o un bloque de refrigeración, preparar la mezcla maestra de PCR mediante la adición de 0,5 l de ADN polimerasa 1 (TDP1) a 25 l de PCR Master Mix 2 (PMM2) por muestra. Invertir, rápidamente vórtice, y centrifugar brevemente la PCR Master Mix para mezclar. Añadir 22 l de la mezcla maestra de PCR a cada pocillo de la IAP y la pipeta hacia arriba y abajo 3 veces para mezclar. Cambiar las puntas entre los pozos. Mantenga la IAP a 4 ° C. Después de los 45 min de reacción de extensión-ligación (paso 4.1.10), retire la FPU de la incubadora y retirar con cuidado la columinum sello de aluminio. Cubrir con la tapa y se centrifuga a 2.250 g durante 3 min a 20 ° C. Añadir 25 l de NaOH 50 mM a cada pocillo de muestra en la FPU. Pipetear arriba y abajo de al menos 6 veces; asegurar las puntas de pipeta entrar en contacto con la membrana. Cambie las puntas después de cada columna. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Transferir las muestras eluyeron de la FPU a la IAP como sigue: Usando una pipeta multicanal p100 ajustado a 20 l, pipetear el NaOH en la placa de FPU arriba y hacia abajo al menos 6 veces. Incline ligeramente la placa FPU para garantizar la aspiración completa de la placa. Transferencia de 20 l de la FPU a la columna correspondiente de la IAP. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 6 veces para combinan a fondo el ADN con la mezcla maestra de PCR. Sellar la IAP con película adhesiva y se centrifuga a 1.000 xg durante 1 min a 20 ° C. Llevar la placa de PCR en la sala de post-PCR y la carga de la placa en un termociclador. Ejecutar el PCR programa que consiste en un paso de desnaturalización de calor a 95 ° C durante 3 min; seguido por 25 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; seguido de una extensión final de 72 ° C durante 5 min; terminando con un mantenimiento a 10 ° C. Si no proceder a la siguiente etapa después de la finalización de la PCR, la placa puede permanecer en el ciclador térmico durante la noche, o puede ser almacenado a 2-8 ° C hasta dos días. La purificación de PCR y Normalización basado en perlas Retire las perlas magnéticas, de purificación de tampón de elución (EBT), y reactivos de la electroforesis en gel del 4 ° C nevera y lugar a temperatura ambiente al menos 20 min antes de la siguiente etapa. Una vez que la PCR se haya completado, se centrifuga a 1.000 xg durante 1 min a 20 ° C para recoger la condensación. Transferencia de 1 l de cada reacción de PCR para la tira de tubos / pocillos de las placas que contienen 4 l de agua para diluir las muestras 1/5. Pipetear arriba y abajo para mezclar. Añadir 2 l de ladiluido muestras PCRed a 2 l de tampón de microfluidos-gel. Sellar las tiras / placa. Se agita a 1800 rpm durante al menos 30 segundos y se centrifuga a 1000 xg durante 30 seg. Siguiendo el protocolo del fabricante, ejecute la mezcla en un gel de microfluidos para evaluar si la preparación de la biblioteca produjo una biblioteca aceptable (véase la Figura 3). Vórtice de purificación de las perlas magnéticas hasta que estén bien suspendidas y el color aparece homogénea. Añadir 45 l de las perlas para cada muestra. Sellar la placa con película adhesiva transparente y agitar la placa a 1.800 rpm durante 2 minutos. Se incuba a temperatura ambiente sin agitación durante 10 min. Coloque la fuente sobre un soporte magnético. Una vez que el sobrenadante se haya resuelto, retirar con cuidado y desechar el sobrenadante. Si ningún perlas son aspiradas inadvertidamente en las puntas, prescindir de las perlas de nuevo a la placa y dejar que la placa de apoyo en el imán durante 2 minutos y confirme que el sobrenadante se haya resuelto. Con la placa de tque soporte magnético, añadir 200 l de recién preparada etanol al 80% a cada pocillo de muestra. Mover la placa de ida y vuelta un par de veces. Se incuba la placa en el soporte magnético durante 30 segundos. Con cuidado, retirar y desechar el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados. Eliminar el exceso de etanol por centrifugación brevemente la placa a 1000 xg para reducir cualquier etanol en los lados del tubo, la colocación de la placa posterior en el soporte magnético, y el uso de una pipeta de p10 de múltiples canales ajustado a 10 l para eliminar el etanol. Permitir que las perlas se sequen al aire durante 5 – 8 minutos. Usando una pipeta multicanal p100, añadir 30 l de EBT a cada pocillo. Pipetear arriba y abajo varias veces para asegurar las perlas vienen del lado del tubo. Sellar la placa con película adhesiva transparente y agitar la placa a 1.800 rpm durante 2 minutos. Se incuba a temperatura ambiente sin agitación durante 3 min. Si hay muestras en las que los granos no se resuspendió completamente, suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para volver a suspender las perlas. Colocar la placa en un soporte magnético. Usando una pipeta multicanal p100, la transferencia de 20 l del sobrenadante a una placa nueva llamada la placa Biblioteca Normalización (LNP). La transferencia de los restantes 10 ~ l de las bibliotecas de secuenciación individuales de una placa separada llamada la restante plano limpio Biblioteca Plate (RCLP). Almacenar esta placa junto con la preparación de la biblioteca final, ya que se puede utilizar como una reserva para una segunda carrera de secuenciación, si es necesario. Si no proceder a la siguiente etapa, la LNP y RCLP se pueden almacenar a -15 a -25 ° C. Vigorosamente vórtice y volver a suspender la biblioteca de los granos de normalización 1 (LNB 1). Es crítico para resuspender completamente el sedimento LNB1 talón en la parte inferior del tubo. Preparar la mezcla de normalización, mediante la mezcla de 8 l de LNB1 con 44 l de Normalización Biblioteca Aditivos 1 (LNA1) por muestra. Vigorosamente la mezcla vórtice Normalización durante 10 – 20 segundos. PRECAUCIÓN: LNA1 contiene formamida. Con una inversión de intermitentend agitación de la mezcla de Normalización, añadir 45 l de cada muestra de la LNP. Sellar la placa con película adhesiva transparente y agitar la placa a 1.800 rpm durante 30 min. Este 30 min de incubación es crítica para la correcta normalización de la biblioteca como incubaciones de mayor o menor que 30 min puedan afectar a la representación de la biblioteca y la densidad de clúster. Durante los 30 minutos de incubación, preparar los reactivos para secuenciación descongelando el cartucho de reactivos y Hyb Buffer (HT1) [PRECAUCIÓN: Ambos contienen formamida]. Además, conseguir hielo para un paso posterior y garantizar un bloque de calor adecuado para tubos de 1,5 ml de centrífuga se establece en 96 ° C. Cuando la etapa de mezcla 30 min se ha completado, colocar la LNP en un soporte magnético. Una vez que el sobrenadante se haya resuelto, utilizar una pipeta multicanal para retirar cuidadosamente y desechar el sobrenadante en el contenedor de residuos adecuado. Eliminar la LNP del soporte magnético y lavar las perlas con la biblioteca de Normalización de lavado 1 (LNW1) como sigue: Añadir 45l de LNW1 a cada pocillo de muestra. PRECAUCIÓN: Contiene formamida. Sellar la placa con película adhesiva transparente y agitar la placa a 1.800 rpm durante 5 min. Repita para un total de dos lavados. Asegúrese de eliminar todo el LNW1 después del segundo lavado. Eliminar la LNP del soporte magnético y, usando una pipeta multicanal, añadir 30 l de NaOH 0,1 N (menos de una semana de edad) a cada pocillo para eluir la muestra. Sellar la placa con película adhesiva transparente y agitar la placa a 1.800 rpm durante 5 min. Durante el 5 min de elución, añadir 30 l de biblioteca de Normalización Storage Buffer 1 (LNS1) a cada pocillo para ser usado en una nueva placa llamada la placa de almacenamiento (SGP). Coloque la LNP en el soporte magnético. Una vez que el sobrenadante se haya resuelto, la transferencia de la elución de 30 l para la LNS1 en el PEC. Cambiar las puntas entre muestras para evitar la contaminación cruzada. Sellar la placa con película adhesiva y se centrifuga a 1000 xg durante al menos 30 seg. Añadir 51; l de cada muestra que se secuenció para un amplicón Biblioteca Pooled marcado (PAL) tubo de 1,5 ml. Vórtice del PAL para mezclar y centrifugar brevemente en una microcentrífuga. Dependiendo de qué química de secuenciación se esté utilizando (V2 o V3) añadir 4 – 10 l de la PAL de 590 – 596 l de HT1. En general, añadir 5,8 l de PAL a 595 l de HT1 para la química V2 y 8,5 l de PAL a 592 l de HT1 para la química V3. Etiqueta este tubo a medida que el tubo diluido amplicón Biblioteca (DAL). Vórtice del DAL y brevemente de girar en una microcentrífuga. Incubar la DAL a 96 ° C durante 2 min. Invertir el tubo DAL 3 veces y poner el DAL en hielo durante al menos 5 min, mientras se prepara el secuenciador para la secuenciación. Después de la 5 min, la DAL está listo para ser cargado. Si terminado con el PEC, sellar la placa con papel de aluminio película adhesiva y la etiqueta con la fecha y la placa de identificación. Almacenar el PEC sellada y PAL de -15 a -25 ° C. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figura 3:. Biblioteca de preparación del control de calidad del gel Ejemplo La línea verde sobre las bandas más bajas es indicar el marcador inferior y la línea púrpura sobre las bandas superiores es para indicar el marcador más alto. Todo funcionaba bien para los carriles H1, A2, B2, C2, E2, y G2. La preparación de la biblioteca no funciona de manera óptima, por carriles D2, F2 y H2, pero los resultados todavía será obtenida apenas puede ser que no tenga una cobertura adecuada. Para A3, la preparación de la biblioteca apenas funcionaba y lo más probable es que esta muestra de ADN no era adecuado para el ensayo. Las bandas más bajas por encima de la marca más baja son los cebadores no utilizados, debido a que la muestra se toma directamente de la PCRed bien. La muestra NTC sólo debe tener la banda no utilizado de imprimación, y nada más. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Secuenciación Asegurar una correcta SampleSheet.csv se ha hecho para la carrera. Ver Figura 1 complementario para un ejemplo. Enjuague y seque la celda de flujo y añadir 600 l de la DAL para el cartucho de reactivos descongelado. Prepare el secuenciador para la secuenciación siguiendo las instrucciones que aparecen en pantalla. Análisis 6. Datos Ejecutar el gasoducto bioinformática. Utilizar la tubería bioinformático en la empresa, diseñado a medida para identificar las mutaciones, inserciones, supresiones y amplificaciones 18. Después de la tubería ha completado, compruebe los archivos de registro de errores / advertencia, ya que cualquier ayuda significativa errores / advertencias en el control de calidad del procesamiento en paralelo. Analizar las estadísticas de ejecución (Tabla 3) para asegurar la biblioteca secuenciado ha pasado el laboratorio determina las métricas de control de calidad (Figura 4). Revisar manualmente cada variante mediante la visualización de los archivos .bam en un visor de datos genómica (por ejemplo, el Integrativa Genómica Vijarro 16 (IGV)). NOTA: Sólo las variantes dentro de la gama de frecuencias de alelos y validado por encima de la profundidad mínima de cobertura después de la filtración de calidad se dan (usando la nomenclatura del Genoma Humano Variación Sociedad (vehículos pesados)). Para informes finales, cada variante exonic se clasifican en: patógena, probablemente enfermedad asociada, variante de significado desconocido (VUS), probablemente benigna, y benignos. Todas las variantes anteriores, los criterios de notificación de 5% la frecuencia de alelos, con excepción de aquellas variantes consideradas benignas y sinónimo cambios, se informó. Figura 4. Vista general de Control de Calidad Pasos para NGS. El control de calidad de cada paso en el proceso es necesario para asegurar la secuenciación dará resultados tales que las métricas de secuenciación de pre y post son considerados. tratamiento espécimen apropiada es esencial para el ADN de alta calidad. sangre ymédula ósea en fijadores inapropiados puede producir ADN de baja calidad. La fijación inadecuada de las muestras de tumor sólido puede degradar el ADN (por ejemplo, la fijación en B5). la calidad del ADN se debe evaluar la contaminación de proteínas y ARN por medio de espectrofotometría, y evaluarse con precisión la cantidad y la integridad del ADN. Las métricas de secuenciación deben ser determinados empíricamente en el laboratorio secuenciación y seguido para cada reacción de secuenciación y cada espécimen. Antes de informar sobre los resultados de secuenciación para cada muestra deberá determinar, en la cobertura, la profundidad y el desempeño adecuado de controles positivos y negativos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.