Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

Questo protocollo comprende le fasi salienti di due prove di laboratorio sviluppato convalidate per il profilo genomico di tumori solidi e liquidi, rispettivamente. Il test eseguito in laboratorio è fatto in conformità con i requisiti dei Clinical Laboratory Improvement emendamenti (CLIA) del 1988. 1. Estrazione del DNA dal sangue periferico o midollo osseo Determinare la quantità di sangue o midollo osseo a prendere basa sulla Tabella 1. Esempio / WBC Importo di essere trattato come 1 ml di sangue Bone Marrow 250 microlitri WBC Sangue 12.000 – 50.000 1 ml WBC Sangue 50,000 – 100,000 500 microlitri WBC Sangue 100.000 – 200.000 200 l </ Td> WBC Sangue> 200.000 100 pl * For Blood WBC <12.000, prendere 2 ml di sangue Tabella 1:. Il sangue / midollo osseo Volume per Usa mappa Dal momento che il numero di globuli bianchi può variare da campione a campione, è difficile indicare un volume specifico di sangue da utilizzare. Pertanto, la quantità di sangue da utilizzare per il saggio deve essere determinata osservando il numero dei globuli bianchi (WBC) prima di iniziare il dosaggio. Sebbene meno sangue viene utilizzato, esso dovrebbe essere trattata come se le sue 1 ml Poiché il volume di sangue utilizzato è ridotta perché il numero di cellule presenti è maggiore del normale. Seguire il protocollo del kit disponibile in commercio per isolare il DNA genomico. 2. DNA Estrazione da paraffina-embedded (FFPE) tessuto fissato in formalina Basato sula regione del tumore il patologo cerchiata sul vetrino H & E, allineare i vetrini non colorati con la guida di H & E scivolo e delineare una zona simile per l'estrazione. Per macro-dissezione, processo di un solo esemplare / set del paziente di diapositive alla volta. Scaldare i vetrini su un blocco C di calore di 45 ° o leggermente fondere la paraffina. raschiare delicatamente il tessuto all'interno delle linee che sono contrassegnati sul vetrino, con un nuovo bisturi per ogni campione da estrarre. Posizionare la raschiatura cera nel tubo adeguatamente etichettati 1,5 ml. Bisogna fare attenzione perché la cera è molto raschiato elettrostatico e può saltare fuori dal tubo. Aggiungere 320 ml di Sparaffinatura soluzione per ogni cinque o sei 5 sezioni micron (25 – 30 micron totali). Ad esempio, se un tubo contenente 3 sezioni di 10 micron rotolo / arricciatura sta per essere trasformati, quindi utilizzare 320 microlitri, ma se sono stati ottenuti 5 sezioni allo stesso spessore quindi utilizzare 640 microlitri. Vortex vigorosamente per almeno 10 secondi ed eseguire aqrotazione uick in una microcentrifuga per rimuovere il tessuto / cera dai lati e cappuccio e nella soluzione. Incubare a 56 ° C per 3 min, e incubare a temperatura ambiente per 5 -. 10 min. Dopo l'incubazione RT, aggiungere 180 ml di tampone ATL per ogni 320 ml di soluzione Sparaffinatura aggiunto. Tritare il tessuto dieci volte con un mini-pestello sterile utilizzando una nuova pestello per ogni campione. Assicurarsi che vi sia nessun tessuto attaccato al pestello, come può essere molto appiccicoso. Vortex la sospensione vigorosamente per 3 secondi, quindi si centrifuga alla massima velocità per 1 min. Aggiungere 10 ml di proteinasi K alla fase chiara inferiore. Mescolare delicatamente pipettando su e giù per garantire il tessuto viene risospeso. Non lo fanno vortice. Incubare a 56 ° C per una notte con agitazione a 400-500 giri al minuto. La mattina successiva, verificare se il tessuto è completamente sciolto (questo si è verificato se la soluzione più bassa è chiaro). Se la soluzione inferiore non è chiaro, quindi vortice vigorosamente per 3 secondi e centrifugare a massima velocità for 1 min. Aggiungere un extra 5 – 10 ml di proteinasi K e incubare a 56 ° C per altri 30 – 60 min. Incubare a 90 ° C per 1 ora per contribuire a invertire la formaldeide reticolazione. Lasciare che i campioni raffreddare a temperatura ambiente per 5 – 10 minuti e poi centrifugare brevemente ciascun tubo per consolidare il liquido. Trasferire la fase chiara in basso in una provetta etichettata 1,5 ml. Se vi sono più tubi di stesso campione del paziente (ad esempio il caso se vengono utilizzate più rotoli), ricombinare le fasi inferiori in un tubo a questo punto. Nota: Trasferimento di piccole quantità di soluzione Deparaffinizzazione non dovrebbe interferire con la procedura di purificazione, ma vi è un rischio se una grande quantità viene trasferito. Aggiungere 2 ml di soluzione di RNase A. Vortex delicatamente o invertire 25 volte e rotazione rapida in una microcentrifuga. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 200 ml di proteine ​​precipitazioni Solution. Se facendo uno o due panini, usare 200 ml. Se facendo tre rullis in una sola volta, quindi utilizzare 400 ml. Vortex vigorosamente ad alta velocità per 30 secondi per mescolare in modo uniforme i buffer di lisi. Incubare in ghiaccio per 5 minuti o campioni possono rimanere sul ghiaccio per un massimo di un ora. Centrifugare a 5000 xg per 5 min. La proteina precipitata dovrebbe formare una stretta, pellet bianco. Versare il supernatante in una provetta etichettata 1,5 ml, e poi incubare i campioni in ghiaccio per almeno 3 minuti. Centrifugare a 5.000 xg per 3 min. Aggiungere 200 ml di 2-propanolo (isopropanolo) per ogni 180 ml di tampone ATL inseriti anteriormente alla provetta da 1,5 ml (potrebbe essere necessario utilizzare un tubo 2 ml). Ad esempio, se facendo tre rotoli aggiungono 600 ml di isopropanolo. Aggiungere 1 ml di glicogeno per ogni 180 ml di tampone ATL aggiunto in precedenza per l'isopropanolo e capovolgere il tubo più volte per mescolare. Aggiungere con cautela il surnatante dal punto di proteine ​​Precipitazione nella miscela isopropanolo. Mescolare il tubo capovolgendo delicatamente almeno 50 volte. Centrifugare a massima speed per 3 min. Il DNA sarà visibile come piccoli pellet bianco sul fondo della provetta. Versare o aspirare il surnatante nel tubo dei rifiuti. Mantenere una provetta da 1,5 ml differenziata per ciascun campione nel caso in cui il pellet viene sloggiato in modo da non essere perso o mescolato con lo spreco di altri esemplari. Scolare il tubo su un tovagliolo di carta e garantire la maggioranza della isopropanolo viene rimosso. Aggiungere 300 ml di appena fatto il 70% di etanolo. Capovolgere la provetta delicatamente più volte per lavare il pellet. Cercare di garantire il pellet viene sloggiato per garantire una pulizia più accurata. Centrifugare a massima velocità per 5 min. e poi rimuovere con attenzione l'etanolo. Il pellet può essere sciolto, in modo da versare o aspirare lentamente e guardare il pellet. Rimuovere l'eccesso di etanolo dall'interno del tubo, senza toccare il pellet. Consentire ai campioni di aria secca per 5 – 15 minuti, facendo attenzione a non più di asciugare il campione. Aggiungere tra 25-100 ml di DNA idratazione soluzione di ecampione gni base alle dimensioni del pellet di DNA e l'importo iniziale di tessuto. Vortex tubi energicamente e brevemente girare in una microcentrifuga. Incubare per 1 ora a 65 ° C per reidratare pienamente il DNA. 3. Controllo Qualità DNA genomico Nota: Ci sono tre fasi indipendenti per il controllo della qualità del DNA (QC). Vedere la Tabella 2 per ulteriori spiegazioni del motivo per cui viene eseguito ogni passaggio di controllo di qualità. Strumento Risultato Indicazione gamma ideale DropSense96 A260 / A230 L'identificazione di contaminanti chimici (per esempio, etanolo) 1,50-2,2 DropSense96 A260 / A280 Identificazione di contaminanti proteici 1,60-2,2 DropSense96 Concentrazione la quantificazione del DNA > 1 ng / ml TapeStation DNA Smear Determinazione della integrità del DNA (ad esempio, la degradazione / frammentazione del DNA estratto) 50%> 1000 bp qubit 2.0 Concentrazione Più precisa quantificazione del DNA > 1 ng / ml Tabella 2:. DNA QC Risultati attesi Tutti questi valori sono presi in considerazione prima di eseguire permettendo un campione di procedere alla fase di preparazione biblioteca. Seguendo il protocollo del produttore, eseguire 2 ml di DNA estratto su un fluorimetro per ottenere la concentrazione di lavoro (ng / ml) del campione. Eseguire 1 – 2 ml di ogni campione su un UV / VIS spettrofotometro per controllare la qualità del campione (A260 / A230 e A260 / A280 rattoios) secondo le istruzioni del produttore. Per FFPE campioni: Seguendo le istruzioni del produttore, eseguire 1 ml di ogni campione su un sistema di gel-elettroforesi microfluidica per valutare il degrado / frammentazione del DNA. Vedere la Figura 2 per gli esempi. Figura 2:. Il DNA genomico QC Gel Esempio La linea verde sopra le fasce più basse è quello di indicare il marcatore più bassa. La linea rossa aggiunto-in è quello di indicare circa 1.000 bp. Corsia A2 rappresenta DNA completamente intatto, come ci si aspetterebbe da Sue tis fresco (ad esempio, sangue periferico o midollo osseo). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 sono esempi di buona, DNA FFPE intatto. Il DNA in corsia F2 sembra essere intatto, ma ad una concentrazione troppo bassa. Il DNA in corsia G2 è degradato o frammentato e non funzionerà nel saggio. Corsie E1, F1, G1, H1, D2,H2 rappresentano il DNA che rientra nella 'zona grigia' il che significa che il test potrebbe funzionare bene, ma un po 'del DNA potrebbe essere troppo danneggiato o reticolato e quindi non si esibirà anche nel dosaggio. Cliccate qui per visualizzare un più grande versione di questa figura. 4. Amplicon Biblioteca Preparazione Ibridazione di Oligo Pool e Extension-legatura di Oligos Bound Nella sala pre-PCR, aggiungere il volume necessario di Low EDTA TE, 5 ml di tubo Oligo del pannello (ad esempio, Solid-NGS Panel o eme-NGS Panel), e 100-250 ng di DNA genomico per ciascuna corrispondente bene in un 96 ben piatto semi-gonna etichettato come il (HYB) piastra di ibridazione. Aggiungere 40 ml di oligo Ibridazione per il sequenziamento reagente 1 (OHS1) per ogni campione nella piastra HYB. Delicatamente pipetta su e giù almeno 5 – 6 volte per mescolare. Modificare suggerimenti dopo ogni colonna per evitarecontaminazione incrociata. Sigillare la piastra HYB con un foglio di alluminio adesivo e centrifugare a 1000 xg per 30 sec. Incubare la piastra HYB nella ibridazione incubatore pre-riscaldato a 95 ° C per 1 min. Impostare la temperatura dell'incubatore ibridazione a 40 ° C. Continuare incubazione finché prende l'incubatrice diminuire da 95 ° C a 40 ° C (~ 90 min). Nota: Questo raffreddamento graduale è fondamentale per il corretto ibridazione. Durante gli ultimi 15 – 20 min di incubazione ibridazione, pre-lavare il gruppo filtro piastra (FPU). Preparare solo i pozzetti da utilizzare nel saggio corrente, cioè, utilizzare solo / pozzetti non utilizzati freschi di una piastra filtro aperto in precedenza, ma mai riutilizzare pozzetti che sono stati utilizzati. Nota: Questo dovrebbe essere chiaro in base al numero kit sulla piastra di filtraggio, i segni sulla piastra di filtraggio, e il sigillante usato tutta la piastra. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 45 ml di lavaggio stringente 1 (SW1) in ciascun pozzetto. <br /> ATTENZIONE: Contiene formammide. Coprire e centrifugare la FPU a 2.250 xg per 3 minuti a 20 ° C. Controllare ogni bene per liquido residuo (> 15 ul / pozzetto). Se esiste residui di liquido, ruotare la FPU a 180 ° e ripetere il passo centrifugare per un ulteriore 3 min. Se il liquido residuo gira attraverso la seconda volta, quindi procedere al passaggio successivo, se poi non ci può essere un difetto nella piastra di filtraggio e dovrà essere sostituito il piatto corrente. Una volta che l'incubatore ibridazione è stata raffreddata a 40 ° C, centrifugare la piastra a 1.000 xg per almeno 30 sec a 20 ° C per raccogliere condensa. Trasferire l'intero volume di ogni campione dalla piastra HYB sul centro dei corrispondenti pozzetti pre-lavati della FPU. Cambiare suggerimenti dopo ogni colonna per evitare la contaminazione incrociata. Coprire la FPU e centrifugare a 2.250 xg per 3 minuti a 20 ° C. Aggiungere 45 ml di SW1 e centrifugare a 2.250 xg per 3 min a 20 ° C. Ripetere per un totale di due lavaggi. Ruotare il FPU a 180 ° e centrifugare di nuovo a 2.250 xg per 3 min per rimuovere completamente tutte le SW1. Dissimulare la FPU. Eliminare tutto il flow-through (contenente formammide) nel contenitore per rifiuti corretta. Rimontare la FPU utilizzando un diverso piatto MIDI raccolta dei rifiuti. Aggiungere 45 ml di tampone universale 1 (UB1) a ciascun pozzetto e centrifugare a 2.250 xg per 3 min a 20 ° C. ATTENZIONE: Contiene formammide. Aggiungere 45 ml di estensione legatura Mix 3 (ELM3) per ciascun pozzetto sulla piastra FPU e pipetta su e giù per 3 volte per mescolare. Nota: La reazione di estensione-legatura avviene sulla membrana piastra di filtraggio. Sigillare la piastra FPU con foglio di alluminio adesivo ed incubare l'intero gruppo FPU in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 45 min. Indicizzazione e PCR Amplification Un'aliquota gli indici utilizzati per i pozzi corrispondenti nella indicizzato Amplification Plate (IAP) disponendo i primer nel dispositivo Index Piastra, disposti nel modo seguente: i tubi di primer i5 (cappucci bianchi, soluzione limpida) in verticale, in linea con le righe da A a H, tubi i7 di primer (tappi arancione, soluzione gialla) in senso orizzontale , in linea con le colonne da 1 a 12. Utilizzando un p10 multicanale pipetta, aggiungere 4 ml di primer i7 (soluzione gialla) a ogni riga della IAP e aggiungere 4 ml di primer i5 (soluzione chiara) per ogni colonna della IAP. Su ghiaccio o un blocco di raffreddamento, preparare la PCR Master Mix con l'aggiunta di 0,5 ml di DNA polimerasi 1 (TDP1) a 25 ml di PCR Master Mix 2 (PMM2) per campione. Inverti, in modo rapido vortice, e centrifugare brevemente la PCR Master Mix per mescolare. Aggiungere 22 ml di PCR Master Mix per ogni pozzetto della IAP e pipetta su e giù per 3 volte per mescolare. Cambiare punte tra i pozzi. Mantenere la IAP a 4 ° C. Dopo il 45 min Extension-legatura di reazione (fase 4.1.10), rimuovere la FPU dal termostato e rimuovere con attenzione di aluminum sigillo di alluminio. Coprire con il coperchio e centrifugare a 2.250 xg per 3 min a 20 ° C. Aggiungere 25 ml di 50 mM NaOH a ciascun campione sulla buona FPU. Pipettare su e giù almeno 6 volte; garantire che i puntali delle pipette venire a contatto con la membrana. Modificare suggerimenti dopo ogni colonna. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. campioni di trasferimento eluiti dalla FPU per la IAP come segue: Utilizzando un p100 pipetta multicanale impostato a 20 ml, pipetta la NaOH sulla piastra FPU su e giù per almeno 6 volte. Inclinare leggermente la piastra FPU per garantire l'aspirazione totale fuori la piastra. Trasferimento 20 microlitri dalla FPU al corrispondente colonna della IAP. Delicatamente pipetta su e giù per almeno 6 volte di combinare accuratamente il DNA con la PCR Master Mix. Sigillare la IAP con pellicola adesiva e centrifugare a 1000 xg per 1 minuto a 20 ° C. Portare la piastra PCR nella camera post-PCR e caricare la piastra su un termociclatore. Eseguire la PCR program costituito da un calore denaturazione fase a 95 ° C per 3 min; seguita da 25 cicli di 95 ° C per 30 sec, 62 ° C per 30 sec, 72 ° C per 60 sec; seguita da una estensione finale di 72 ° C per 5 min; terminando con una sospensione a 10 ° C. Se non procedere alla fase successiva dopo il completamento della PCR, la piastra può rimanere sul termociclatore overnight, oppure può essere conservato a 2 e 8 ° C fino a due giorni. PCR Purificazione e normalizzazione Bead-Based Rimuovere le sfere di purificazione magnetiche, tampone di eluizione (EBT), e reagenti gel elettroforesi dalla C frigorifero 4 ° e posto a temperatura ambiente almeno 20 minuti prima della fase successiva. Una volta che la PCR è completa, centrifugare a 1000 xg per 1 min a 20 ° C per raccogliere condensa. Trasferire 1 ml di ogni reazione PCR a striscia tubi / pozzetti della piastra contenente 4 ml di acqua per diluire i campioni 1/5. Pipetta su e giù per mescolare. Aggiungere 2 ml didiluito campioni PCRed a 2 ml di buffer di microfluidica-gel. Sigillare la strisce / piastra. Agitare a 1.800 rpm per almeno 30 secondi e centrifugare a 1000 xg per 30 sec. Seguendo il protocollo del produttore, eseguire il composto su un gel microfluidica per valutare se la preparazione biblioteca prodotto una libreria accettabile (vedere Figura 3). Vortice le sfere di purificazione magnetica fino a quando sono ben sospesi e il colore appare omogeneo. Aggiungere 45 ml di perline per ogni campione. Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente e agitare la piastra a 1.800 rpm per 2 minuti. Incubare a temperatura ambiente, senza agitazione per 10 min. Porre la piastra su un supporto magnetico. Una volta che il surnatante ha autorizzato, rimuovere con attenzione e scartare il surnatante. Se qualche perle sono inavvertitamente aspirati nelle punte, dispensare le perle di nuovo alla piastra e lasciare che il resto piatto sul magnete per 2 minuti e confermare che il surnatante ha eliminato. Con la piastra su tegli supporto magnetico, aggiungere 200 ml di preparati al momento 80% di etanolo per ogni campione. Spostare la piastra in avanti e indietro un paio di volte. Incubare la piastra sul supporto magnetico per 30 sec. Rimuovere con cautela e scartare il surnatante. Ripetere per un totale di due lavaggi. Rimuovere l'eccesso di etanolo mediante centrifugazione brevemente la piastra a 1.000 xg per ridurre qualsiasi etanolo sui lati del tubo, ponendo la piastra posteriore sul supporto magnetico e usando una pipetta multicanale p10 impostata a 10 microlitri per rimuovere l'etanolo. Lasciare le perline per asciugare per 5-8 min. Utilizzando un p100 pipetta multicanale, aggiungere 30 ml di EBT a ciascun pozzetto. Pipetta su e giù un paio di volte per garantire le perline venire fuori il lato del tubo. Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente e agitare la piastra a 1.800 rpm per 2 minuti. Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 3 min. Se ci sono esempi in cui le sfere non sono completamente risospese, delicatamente pipetta su e giù per risospendere le sfere. Posizionare la piastra su un supporto magnetico. Utilizzando un p100 pipetta multicanale, trasferire 20 ml del surnatante in un piatto completamente nuovo chiamato la piastra Biblioteca Normalizzazione (LNP). Trasferire i restanti ~ 10 ml di singole biblioteche di sequenziamento di un piatto a parte chiamato il rimanente ripulito Biblioteca Piastra (RCLP). Conservare questa piastra con il prep libreria finale, in quanto può essere utilizzato come riserva per una seconda corsa di sequenziamento, se necessario. In caso contrario procedere alla fase successiva, la LNP e RCLP possono essere conservati a -15 a -25 ° C. Vigorosamente vortice e risospendere la Biblioteca Beads normalizzazione 1 (LNB1). È fondamentale per risospendere completamente i pellet LNB1 tallone sul fondo della provetta. Preparare la normalizzazione Mix, mescolando 8 ml di LNB1 con 44 ml di Biblioteca Normalizzazione Additivi 1 (LNA1) per campione. Vigorosamente vortice la normalizzazione Mix per 10-20 sec. ATTENZIONE: LNA1 contiene formammide. Con intermittente inversione unND vortex della normalizzazione Mix, aggiungere 45 ml di ogni campione della LNP. Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente e agitare la piastra a 1.800 rpm per 30 min. Questo min di incubazione 30 è fondamentale per il corretto normalizzazione libreria come incubazioni più o meno di 30 min possono influenzare rappresentazione biblioteca e densità di cluster. Durante il 30 min di incubazione, preparare i reagenti per il sequenziamento da scongelamento la cartuccia del reagente e ibridazione Buffer (HT1) [ATTENZIONE: Entrambi contengono formammide]. Inoltre, ottenere ghiaccio per un passaggio successivo e garantire un blocco di calore adatto per provette da 1,5 ml centrifuga è impostato a 96 ° C. Quando la fase di miscelazione 30 min è completa, posizionare il LNP su un supporto magnetico. Una volta che il surnatante ha autorizzato, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere con attenzione e scartare il surnatante nel contenitore dei rifiuti. Rimuovere la LNP dal supporto magnetico e lavare le perline con Biblioteca Normalizzazione Wash 1 (LNW1) come segue: Aggiungere 45pl di LNW1 per ciascun campione. ATTENZIONE: Contiene formammide. Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente e agitare la piastra a 1.800 rpm per 5 min. Ripetere per un totale di due lavaggi. Assicurarsi di rimuovere tutti i LNW1 dopo il secondo lavaggio. Rimuovere la LNP dal supporto magnetico e, usando una pipetta multicanale, aggiungere 30 ml di 0,1 N NaOH (meno di una settimana) a ciascun pozzetto per eluire il campione. Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente e agitare la piastra a 1.800 rpm per 5 min. Durante la 5 min eluizione, aggiungere 30 ml di Biblioteca Normalizzazione bagagli Buffer 1 (LNS1) in ciascun pozzetto per essere utilizzato in una nuova piastra di nome della piastra di stoccaggio (PSC). Posizionare la LNP sul supporto magnetico. Una volta che il surnatante ha autorizzato, trasferire l'eluizione 30 microlitri al LNS1 nel PSC. Cambiare punte tra i campioni per evitare la contaminazione incrociata. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e centrifugare a 1000 xg per almeno 30 sec. Aggiungere 51; l di ciascun campione da sequenziato a un pool Amplicon libreria etichettato (PAL) provetta da 1,5 ml. Agitare il PAL per mescolare e centrifugare in una microcentrifuga brevemente. A seconda di ciò chimica sequenziamento utilizzato (V2 o V3) aggiungere 4 – 10 ml di PAL a 590 – 596 ml di HT1. Generalmente, aggiungere 5,8 ml di PAL a 595 ml di HT1 per la chimica V2 e 8,5 ml di PAL a 592 ml di HT1 per V3 chimica. Etichettare questo tubo come il tubo diluito Amplicon Library (DAL). Agitare il DAL e brevemente centrifugare in una microcentrifuga. Incubare la DAL a 96 ° C per 2 min. Invertire il tubo DAL 3 volte e mettere il DAL in ghiaccio per almeno 5 minuti, mentre si prepara il sequencer per il sequenziamento. Dopo il 5 min, il DAL è pronto per essere caricato. Se finito con il PSC, sigillare la piastra in alluminio adesiva pellicola stagnola ed etichettarlo con la data e targhetta di identificazione. Conservare il PSC sigillato e PAL a -15 a -25 ° C. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figura 3:. Libreria Prep QC Gel Esempio La linea verde su bande più basse è quello di indicare il marker inferiore e la linea viola sulle bande superiori è quello di indicare il marcatore più alto. Tutto ha funzionato bene per corsie H1, A2, B2, C2, E2, e G2. La preparazione biblioteca non ha funzionato in modo ottimale, per corsie D2, F2, e H2, ma i risultati saranno ancora ottenuto solo che potrebbero non avere una copertura adeguata. Per A3, la preparazione biblioteca funzionava a malapena e molto probabilmente questo campione di DNA non era adeguata per il test. Le fasce più basse sopra il marcatore più basso sono i primer non utilizzati, perché l'aliquota è presa direttamente dal PCRed bene. Il campione NTC dovrebbe avere solo la banda di primer non utilizzati, e nient'altro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 5. Sequencing Assicurare una corretta SampleSheet.csv è stato fatto per la corsa. Vedere la Figura 1 supplementare per un esempio. Risciacquare e asciugare la cella di flusso e aggiungere 600 ml di DAL alla cartuccia reagenti scongelati. Preparare il sequencer per il sequenziamento seguendo le istruzioni sullo schermo. Analisi 6. Dati Eseguire il gasdotto bioinformatica. Utilizzare il gasdotto bioinformatica in-house, progettato su misura per identificare mutazioni, inserzioni, delezioni e amplificazioni 18. Dopo che l'oleodotto ha completato, controllare i file di log per gli errori / warning, come ogni significativo aiuto errori / avvertenze nel controllo di qualità del trattamento pipeline. Analizzare le statistiche run (Tabella 3) per garantire la biblioteca sequenziato ha superato il laboratorio determinato metriche QC (Figura 4). Rivedere manualmente ogni variante visualizzando i file .bam in un visualizzatore di dati genomici (ad esempio, il Integrativa Genomica Vibrocca 16 (IGV)). NOTA: solo le varianti all'interno della gamma allele frequenze convalidato e al di sopra della profondità minima di copertura dopo la filtrazione di qualità sono riportati (utilizzando i mezzi pesanti la nomenclatura di Human Genome Variation Society ()). Per la segnalazione finale, ogni variante exonic è stato classificato in: patogeno, probabilmente la malattia associata, variante sconosciuta rilevanza (VUS), probabilmente benigni, e benigna. Tutte le varianti sopra i criteri di rilevazione del 5% allele frequenza, ad eccezione di quelle varianti benigne ritenuti e cambiamenti sinonimo, sono stati segnalati. Figura 4. Presentazione di Quality gradini di per NGS. Il controllo di qualità di ogni fase del processo è necessario per garantire il sequenziamento produrrà risultati tali che i parametri di sequenziamento pre e post sono considerati. trattamento del campione appropriato è essenziale per DNA di alta qualità. sangue emidollo osseo in fissativi inappropriate può produrre DNA di bassa qualità. La fissazione inadeguato di campioni tumorali solide può degradare il DNA (ad esempio, fissazione in B5). qualità del DNA dovrebbe essere valutata per le proteine ​​e la contaminazione di RNA con mezzi spettrofotometriche, e accuratamente valutato per la quantità e l'integrità del DNA. Le metriche di sequenziamento devono essere determinati empiricamente in laboratorio sequenziamento e seguiti per ciascuna reazione di sequenziamento e ogni campione. Prima di riportare i risultati di sequenziamento per ogni campione dovrebbero essere valutati per la copertura, la profondità, e adeguata esecuzione dei controlli positivi e negativi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.