Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

Dit protocol omvat de voornaamste stappen van twee gevalideerde laboratorium ontwikkelde tests voor de genomische profilering van vaste en vloeibare tumoren, respectievelijk. Het testen uitgevoerd in het laboratorium wordt gedaan in overeenstemming met de eisen van de Clinical Laboratory Improvement amendementen (CLIA) van 1988. 1. DNA-extractie van perifeer bloed of beenmerg Bepalen hoeveel bloed of beenmerg te nemen op basis van Tabel 1. Monster / WBC Bedrag dat moet worden behandeld als 1 ml bloed Beenmerg 250 gl Blood WBC 12.000 – 50.000 1 ml Blood WBC 50.000 – 100.000 500 gl Blood WBC 100.000 – 200.000 200 gl </ Td> Blood WBC> 200.000 100 gl * For Blood WBC <12.000, neem 2 ml bloed Tabel 1:. Bloed / Bone Marrow Volume naar schema gebruiken omdat de witte bloedcellen zal variëren van monster tot monster, is het moeilijk om een bepaald volume bloed gebruikt moet worden. Daarom moet de hoeveelheid bloed te gebruiken voor de assay worden bepaald door te kijken naar de witte bloedcellen (WBC) voor het starten van de test. Hoewel minder bloed wordt gebruikt, moet nog worden behandeld als een 1 ml aangezien de hoeveelheid bloed die wordt verminderd door het aantal aanwezige cellen groter dan normaal. Volg protocol de handel verkrijgbare kit voor het isoleren van genomisch DNA. 2. DNA-extractie van formaline gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) Tissue Gebaseerd opde tumor regio de patholoog omcirkeld op de H & E glijbaan, line-up van de ongekleurde dia's met de gids H & E glijbaan en schetsen een vergelijkbaar gebied voor de extractie. Voor macro-dissectie, proces slechts één exemplaar / set slides patiënt op een moment. Verhit de dia's op een 45 ° C verwarmen blok enigszins smelt de paraffine. Voorzichtig schrapen het weefsel binnen de lijnen die zijn aangegeven op de glijbaan, met behulp van een nieuw scalpel voor elk monster te extraheren. Plaats de wax geschraapt in de juiste label 1,5 ml buis. Wees voorzichtig, want de geschraapt wax is zeer elektrostatische en kunnen uit de buis te springen. Voeg 320 ul van deparaffinisatie oplossing voor elke 5:55 5 urn secties (25 – 30 urn totaal). Als bijvoorbeeld een buis met 3 delen van een 10 um rol / curl zal worden verwerkt, vervolgens 320 pl, maar als 5 secties dezelfde dikte verkregen vervolgens 640 pl. Vortex krachtig gedurende ten minste 10 seconden en uitvoeren aquick draaien in een microcentrifuge om het weefsel / was vanaf de zijkanten en de kap en in de oplossing te verwijderen. Incubeer bij 56 ° C gedurende 3 min, en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 5 -. 10 min. Na de incubatie RT, voeg 180 pl ATL buffer voor elke 320 gl deparaffinisatie oplossing toegevoegd. Gehakt het weefsel tienmaal met een steriele mini-stamper met een nieuwe stamper voor elk specimen. Zorg dat er geen weefsel vast aan de stamper, aangezien het zeer kleverig zijn. Vortex de suspensie krachtig gedurende 3 sec, centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 1 minuut. Voeg 10 ul van proteïnase K aan de onderste heldere fase. Meng voorzichtig door pipetteren en uitschakelt, zodat het weefsel wordt opnieuw gesuspendeerd. Doe NIET vortex. Incubeer bij 56 ° C geïncubeerd onder schudden bij 400-500 rpm. De volgende ochtend, controleer dan of het weefsel volledig is opgelost (dit is gebeurd als de onderste oplossing helder). Waarbij het onderste oplossing niet helder, dan vortex krachtig gedurende 3 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid for 1 min. Voeg een extra 5-10 pl Proteinase K en incuberen bij 56 ° C gedurende nog eens 30-60 min. Incubeer bij 90 ° C gedurende 1 uur om te keren de formaldehyde verknoping. Sta monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten en vervolgens kort centrifugeer elke buis om de vloeistof te consolideren. Breng de onderste duidelijke fase in een gemerkte 1,5 ml buis. Als er meerdere buizen van dezelfde patiënt monster (zoals het geval is wanneer meerdere rollen worden gebruikt), recombineren de onderste fase in een buis op dit punt. Opmerking: kleine hoeveelheden van de deparaffinisatie Solution niet interfereren met de zuiveringsprocedure overdragen, maar er is een risico als een grote hoeveelheid wordt overgedragen. Voeg 2 pl RNase A oplossing. Vortex zachtjes of omkeren 25 keer en snelle draai in een microcentrifuge. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 200 ul Protein Precipitation Solution. Als doet een of twee rollen, gebruikt 200 ul. Als het doen van drie rolls in een keer, gebruik dan 400 ul. Vortex krachtig bij hoge snelheid gedurende 30 seconden gelijkmatig mengen de lysis buffers. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten en de monsters kunnen blijven op ijs gedurende maximaal een uur. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten. Het neergeslagen eiwit zou een strakke, witte pellet te vormen. Giet het supernatant in een gelabelde 1,5 ml buis en incubeer de monsters op ijs gedurende ten minste 3 min. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 3 min. Voeg 200 pl 2-propanol (isopropanol) per 180 gl buffer ATL eerder tot een gemerkte 1,5 ml buizen toegevoegd (het kan nodig zijn een 2 ml tube). Als bijvoorbeeld doen drie rollen voeg 600 pl isopropanol. Voeg 1 ul van glycogeen voor elke 180 ul Buffer ATL eerder tot de isopropanol toegevoegd en draai de buis een paar keer om te mengen. Voeg voorzichtig de bovenstaande vloeistof uit de Protein Neerslag stap naar de Isopropanol mengsel. Meng de buis door het omkeren voorzichtig minstens 50 keer. Centrifugeer bij maximale speed voor 3 min. Het DNA wordt zichtbaar als kleine witte pellet op de bodem van de buis. Gieten of te zuigen uit de bovenstaande in het juiste afval buis. Houd een aparte 1,5 ml afval buis voor elk model in het geval dat de pellet komt verdreven dus het zal niet verloren gaan of gemengd met het afval van andere exemplaren. Giet de buis op een papieren handdoek en zorgen voor de meerderheid van de isopropanol verwijderd. Voeg 300 ul vers bereide 70% ethanol. Keren de buis voorzichtig een paar keer om de pellet te wassen. Probeer de pellet te garanderen komt losgeraakte om een ​​meer grondige reiniging te verzekeren. Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten. en dan verwijder voorzichtig de ethanol. De pellet kan los zijn, dus gieten of aspireren langzaam en kijk naar de pellet. Het overtollige ethanol uit de binnenzijde van de buis, zonder het pellet. Laat de monsters aan de lucht drogen voor 5-15 min, voorzichtig om niet te droog het monster. Voeg tussen 25 – 100 pl DNA Hydration Solution each monster op basis van de grootte van de DNA pellet en de starttijd hoeveelheid weefsel. Vortex de buizen krachtig en kort draaien in een microcentrifuge. Incubeer gedurende 1 uur bij 65 ° C om het DNA volledig te hydrateren. 3. Genomic DNA Quality Control Opmerking: Er zijn drie onafhankelijke stappen DNA kwaliteitscontrole (QC). Zie tabel 2 voor nadere toelichting op de reden waarom elke QC wordt uitgevoerd. Instrument Resultaat aanwijzing Ideaal Range DropSense96 A260 / A230 Identificatie van chemische verontreinigingen (bijvoorbeeld ethanol) 1,50-2,2 DropSense96 A260 / A280 Identificatie van eiwitverontreinigingen 1,60-2,2 DropSense96 Concentratie DNA kwantificering > 1 ng / gl tapestation DNA Smear Bepaling van de DNA-integriteit (bijvoorbeeld afbraak / fragmentatie van geëxtraheerde DNA) 50%> 1000 bp qubit 2.0 Concentratie Nauwkeuriger DNA kwantificering > 1 ng / gl Tabel 2:. DNA QC Verwachte resultaten Al deze waarden in aanmerking worden genomen voordat u waardoor een monster om naar de bibliotheek voorbereidingsfase. Volgende protocol van de fabrikant, run 2 pi van het geëxtraheerde DNA op een fluorometer om de werking concentratie (ng / pl) van het monster te verkrijgen. Run 1-2 pi van elk monster op een UV / VIS spectrofotometer om de kwaliteit van het monster (A260 / A230 en A260 / A280 rat checkios) volgens de instructies van de fabrikant. Voor FFPE monsters: de instructies van de fabrikant, run 1 pi van elk monster op een microfluïde gelelektroforese systeem voor afbraak / fragmentatie van het DNA te bepalen. Zie figuur 2 voor voorbeelden. Figuur 2:. Genomic DNA QC Gel Voorbeeld De groene lijn over het onderste bands is om de onderste markering aan te geven. De toegevoegde in de rode lijn is met ongeveer 1000 bp te geven. Lane A2 vertegenwoordigt volledig intact DNA, zoals men zou verwachten van verse tis sue (bijvoorbeeld perifeer bloed of beenmerg). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 zijn voorbeelden van goed intact FFPE DNA. Het DNA in laan F2 weergegeven intact, maar bij een te lage concentratie zijn. Het DNA in laan G2 is aangetast of gefragmenteerd en zal niet werken in de test. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 vertegenwoordigen DNA dat in de 'grijze zone', wat betekent dat de test goed zou kunnen werken valt, maar sommige van de DNA kan ook worden beschadigd of verknoopt en dus zal het niet goed presteren in de test. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur. 4. Amplicon Bibliotheek Voorbereiding Hybridisatie van Oligo Pool en Extension-Ligatie van Bound Oligo In de pre-PCR kamer, voeg het nodige volume Low EDTA TE, 5 ui van het panel Oligo Tube (bv Solid-NGS Panel of Heme-NGS Panel) en 100-250 ng genomisch DNA aan elke overeenkomstige putje in een semi-skirted 96 goed plaat bestempeld als de hybridisatie (HYB) plaat. Voeg 40 ul van Oligo hybridisatie voor Sequencing Reagent 1 (OHS1) aan elk monster in de HYB plaat. Voorzichtig pipet op en neer ten minste 5-6 keer te mengen. tips verandering na elke kolom te vermijdenkruisbesmetting. Sluit de HYB plaat met zelfklevende aluminiumfolie en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 30 sec. Incubeer de HYB plaat in de voorverwarmde hybridisatie incubator bij 95 ° C gedurende 1 min. Stel de temperatuur van de hybridisatie-incubator tot 40 ° C. Verder incuberen zolang duurt de incubator afnemen van 95 ° C tot 40 ° C (~ 90 min). Opmerking: Deze geleidelijke koeling is belangrijk voor juiste hybridisatie. Tijdens de laatste 15 – 20 min van de hybridisatie incubatie, pre-wassen de Filter Plate Unit (FPU). Bereid alleen de putjes te worden gebruikt in de huidige assay, dat wil zeggen, alleen vers / ongebruikt putjes van een eerder geopende filterplaat, maar nooit hergebruik bronnen die zijn gebruikt. Opmerking: Dit moet duidelijk zijn op basis van de Kit nummer op het filter plaat, de markeringen op het filter plaat, en de kit gebruikt in de plaat. Een multi-kanaal pipet wordt 45 pl Stringency 1 (SW1) aan elk putje. <br /> LET OP: Bevat formamide. Behandel en gecentrifugeerd FPU bij 2250 g gedurende 3 min bij 20 ° C. Controleer elke goed voor de resterende vloeistof (> 15 ul / putje). Als restvloeistof aanwezig, draait de FPU 180 ° en herhaal de centrifugetrap opnieuw gedurende nog 3 minuten. Als de restvloeistof draait met de tweede, ga dan naar de volgende stap, zo niet dan kan er een defect in de filterplaat en het stroomplaatonderdeel zal moeten worden vervangen. Zodra de hybridisatie-incubator is afgekoeld tot 40 ° C, gecentrifugeerd plaat bij 1000 g gedurende tenminste 30 sec bij 20 ° C om condensatie te verzamelen. Breng de gehele volume van elk monster tegen HYB plaat op het midden van de overeenkomstige voorgewassen putjes van de FPU. Wijzig tips na elke kolom om kruisbesmetting te voorkomen. Bedek de FPU en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C. Voeg 45 ul van SW1 en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C. Herhalen voor een totaal van twee wassen. Draai de FPU 180 ° en centrifugeer opnieuw bij 2250 xg gedurende 3 minuten om alle SW1 te verwijderen. Huichelen de FPU. Gooi de doorstroom (met formamide) in de juiste afvalbak. Monteer de FPU met een ander MIDI-Waste Collection Plate. Voeg 45 ul van Universal Buffer 1 (UB1) aan elke monsterholte en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C. LET OP: Bevat formamide. Voeg 45 ul van Extension ligatiemengsel 3 (ELM3) aan elk monster goed op de FPU plaat en pipet op en neer 3 keer om te mengen. Opmerking: Extension-ligatiereactie gebeurt op filterplaat membraan. Sluit de FPU plaat met zelfklevende aluminiumfolie en incubeer de volledige FPU montage in een voorverwarmde 37 ° C incubator gedurende 45 min. Indexeren en PCR-amplificatie Aliquot de indexen gebruikt om de corresponderende putjes in de geïndexeerde Amplification Platen (IAP) door het organiseren van de primers in de Index Plate Fixture, gerangschikt op de volgende wijze: i5 primer buizen (witte caps, heldere oplossing) verticaal, in lijn met rijen A tot en met H, i7 primer buizen (oranje caps, gele oplossing) horizontaal , uitgelijnd met kolommen 1 tot 12. met behulp van een p10 multichannel pipet wordt 4 pl i7 primers (gele oplossing) aan elke rij van de IAP en voeg 4 pi i5 primers (heldere oplossing) voor elke kolom van het IAP. Op ijs of een koelblok, de voorbereiding van de PCR Master Mix door het toevoegen van 0,5 ul van DNA-polymerase 1 (TDP1) tot 25 pi PCR Master Mix 2 (PMM2) per monster. Omkeren snel vortex, en in het kort centrifuge de PCR Master Mix te mengen. Voeg 22 ul van de PCR Master Mix aan elk putje van de IAP en pipet op en neer 3 keer te mengen. Verander tips tussen de putten. Houd de IAP bij 4 ° C. Na de 45 min Extension-ligatiereactie (stap 4.1.10), verwijder de FPU uit de incubator en verwijder voorzichtig de aluminum folie afdichting. Bedek met het deksel en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C. Voeg 25 ul van 50 mM NaOH aan elk monster goed op FPU. Pipet op en neer minstens 6 keer; zorgen de pipetpunten in contact met het membraan. tips verandering na elke kolom. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Doorvoermonsters geëlueerd uit de FPU de IAP als volgt: Met een p100 meerkanaals pipet ingesteld op 20 ui, pipet NaOH op FPU plaat op en neer ten minste 6 maal. Kantel de FPU plaat om volledige aspiratie van de plaat te garanderen. Breng 20 pl van de FPU de overeenkomstige kolom van de IAP. Voorzichtig pipet op en neer ten minste 6 keer grondig combineren het DNA met de PCR Master Mix. Verzegel de IAP met kleeffolie en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min bij 20 ° C. Breng de PCR-plaat in de Post-PCR Kamer en laadt de plaat op een thermocycler. Voer de PCR program bestaande uit een warmte denatureren bij 95 ° C gedurende 3 min; gevolgd door 25 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 62 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 60 seconden; gevolgd door een laatste verlenging van 72 ° C gedurende 5 minuten; eindigend met een greep bij 10 ° C. Zo niet doorgaan naar de volgende stap na voltooiing van PCR, kan de plaat op de thermische cycler nacht blijven, of het kan worden bewaard bij 2-8 ° C tot twee dagen. PCR Purification en Bead-Based Normalisatie Verwijder de zuivering magnetische korrels, Elution Buffer (EBT), gel-elektroforese reagentia van 4 ° C koelkast en plaats bij kamertemperatuur ten minste 20 minuten voor de volgende fase. Zodra de PCR is voltooid, centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min bij 20 ° C om condensatie te verzamelen. Overdracht 1 pi van elke PCR reactie te strippen buizen / putjes bevattende 4 pi water om de monsters te verdunnen 1/5. Pipet op en neer om te mengen. Voeg 2 ul van dePCRed verdunde monsters 2 pl microfluïde-gelbuffer. Sluit de strips / plaat. Schudden bij 1800 rpm gedurende ten minste 30 seconden en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 30 sec. Na protocol van de fabrikant, voert het mengsel op een microfluïde gel te beoordelen of de bibliotheek bereiding leverde een aanvaardbare bibliotheek (zie figuur 3). Vortex de magnetische zuivering kralen tot ze goed opgehangen en de kleur verschijnt homogeen. Voeg 45 ul van de korrels aan elk monster. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 2 minuten. Incubeer bij kamertemperatuur zonder schudden gedurende 10 min. Plaats de plaat op een magnetische standaard. Zodra de bovenstaande heeft ontruimd, verwijder voorzichtig en gooi de supernatant. Als er kralen onbedoeld worden opgezogen in de tips, afzien van de kralen terug naar het bord en laat de plaat rusten op de magneet voor 2 min en te bevestigen dat het bovenstaande is verdwenen. Met de plaat op tHij magnetische stand, 200 ul van vers bereide 80% ethanol toe te voegen aan elk monster ook. Beweeg de plaat heen en weer een paar keer. Incubeer de plaat op de magnetische standaard voor 30 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Herhalen voor een totaal van twee wassen. Verwijder de overtollige ethanol door kort centrifugeren van de plaat bij 1000 xg om te rijden elke ethanol op de buis zijkanten, het plaatsen van de plaat terug op de magnetische stand, en met behulp van een p10 multi-channel pipet ingesteld op 10 ui aan de ethanol te verwijderen. Laat de parels aan de lucht drogen gedurende 5-8 min. Met een p100 meerkanaals pipet wordt 30 ul van EBT aan elk putje. Pipet op en neer een paar keer om ervoor te zorgen de kralen komen van de kant van de buis. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 2 minuten. Incubeer bij kamertemperatuur zonder schudden gedurende 3 min. Als er monsters waarbij de korrels niet volledig geresuspendeerd, voorzichtig pipet op en neer om de kralen resuspenderen. Plaats de plaat op een magnetische standaard. Met behulp van een p100 multi-channel pipet 20 ul van de bovenstaande vloeistof om een ​​geheel nieuwe plaat genaamd de Bibliotheek Normalisatie Plate (LNP). Breng de resterende ~ 10 ul van de individuele sequencing bibliotheken om een ​​aparte plaat genaamd de resterende opgeruimde Library Plate (RCLP). Berg de plaat samen met de uiteindelijke bibliotheek prep, omdat het als een reserve kan worden gebruikt voor een tweede sequentie run, indien nodig. Als dit niet over te gaan tot de volgende fase, kan de LNP en RCLP worden bewaard bij -15 tot -25 ° C. Krachtig Vortex en resuspendeer de Bibliotheek Normalisatie Beads 1 (LNB1). Het is cruciaal om volledig resuspendeer de pellet LNB1 kraal aan de bodem van de buis. Bereid de Normalisatie Mix, door het mengen van 8 pi LNB1 met 44 ul van Bibliotheek Normalisatie Additives 1 (LNA1) per monster. Krachtig vortex de Normalisering Mix voor 10 – 20 sec. LET OP: LNA1 bevat formamide. Met tussenpozen een inversiend vortexen van de Normalisatie Mix, voeg 45 ul aan elk monster van de LNP. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 30 min. Deze 30 min incubatie is belangrijk voor juiste bibliotheek normalisering als incubaties van meer of minder dan 30 minuten kan bibliotheek representatie en cluster dichtheid beïnvloeden. Tijdens de 30 minuten incubatie, de voorbereiding van de reagentia voor sequencing door het ontdooien van het reagens cartridge en Hyb Buffer (HT1) [LET OP: Beide bevatten formamide]. Bovendien krijgen ijs een latere stap en voor een verwarmingsblok geschikt om 1,5 ml centrifugebuizen wordt ingesteld op 96 ° C. Wanneer de 30 min mengstap voltooid is, plaatst de LNP op een magnetische standaard. Zodra de bovenstaande vloeistof is verdwenen, gebruik maken van een multi-channel pipet om voorzichtig te verwijderen en gooi de supernatant in de juiste afvalbak. Verwijder de LNP uit de magnetische standaard en was de kralen met Bibliotheek Normalisatie Wash 1 (LNW1) als volgt: Voeg 45ul van LNW1 aan elk monster ook. LET OP: Bevat formamide. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 5 minuten. Herhalen voor een totaal van twee wassen. Zorg ervoor dat alle LNW1 na de tweede wasbeurt te verwijderen. Verwijder de LNP uit de magnetische standaard en een multi-kanaal pipet wordt 30 pl 0,1 N NaOH (minder dan een week oud) aan elk putje om het monster te elueren. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 5 minuten. Gedurende de 5 min elueren, voeg 30 gl Library Normalisatie opslagbuffer 1 (LNS1) aan elk putje voor gebruik in een nieuwe plaat genaamd de opslag Plate (SGP). Plaats de LNP op de magnetische standaard. Zodra de bovenstaande heeft ontruimd, de overdracht van de 30 pi elutie de LNS1 in het SGP. Verander tips tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen. Verzegel de plaat met kleeffolie en centrifugeer bij 1000 xg gedurende tenminste 30 sec. Voeg 51, l van elk monster waarvan de sequentie een label Samengevoegde Amplicon Library (PAL) 1,5 ml buis. Vortex de PAL te mengen en kort spin down in een microcentrifuge. Afhankelijk van sequencing chemie wordt gebruikt (V2 of V3) toevoegen 4-10 ul van het PAL 590-596 pl HT1. In het algemeen, voeg 5,8 pl PAL 595 gl HT1 V2 chemie en 8,5 pl PAL 592 gl HT1 voor V3 chemie. Label deze buis als de verdunde Amplicon Library (DAL) buis. Vortex de DAL en kort spin down in een microcentrifuge. Incubeer de DAL bij 96 ° C gedurende 2 minuten. Inverteer de DAL buis 3 maal en zet de DAL op ijs gedurende ten minste 5 minuten, wanneer het de sequencer voor sequentiebepaling. Na 5 min wordt het DAL gereed om te worden geladen. Als afgewerkt met de SGP, sluit de plaat met zelfklevende aluminiumfolie film en labelen met de datum en plaat ID. Bewaar de afgedichte SGP en PAL bij -15 tot -25 ° C. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figuur 3:. Library Prep QC Gel Voorbeeld De groene lijn over het onderste bands is om de onderste markering en de paarse lijn over de bovenste banden aan te geven is om de hogere markering aan te geven. Alles werkte goed voor rijstroken H1, A2, B2, C2, E2, en G2. De bibliotheek prep niet optimaal te werken, voor rijstroken D2, F2 en H2, maar de resultaten zullen nog worden verkregen ze misschien gewoon niet voldoende dekking hebben. Voor A3, de bibliotheek prep werkte nauwelijks en het meest waarschijnlijk deze DNA-monster was niet voldoende voor de test. De lagere banden boven de onderste markering zijn de niet-gebruikte primers, omdat de hoeveelheid rechtstreeks uit de PCRed goed wordt genomen. De NTC monster moet alleen de ongebruikte primer band, en niets anders. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Sequencing Zorg voor een correcte SampleSheet.csv is gemaakt voor de run. Zie Aanvullende Figuur 1 voor een voorbeeld. Spoel en droog de stroom cel en voeg 600 ul van de DAL aan de ontdooide reagens cartridge. Bereid de sequencer voor sequencing door het volgen van de aanwijzingen op het scherm. 6. Data Analysis Voer de bioinformatica pijplijn. Gebruik maken van de in-house, speciaal ontworpen bioinformatic pijpleiding naar mutaties, inserties, deleties en amplificaties 18 identificeren. Nadat de pijpleiding is voltooid, controleert u de logbestanden voor fouten / waarschuwing, eventuele significante fouten / waarschuwingen steun in de QC van de pijpleiding verwerking. Analyseer de run statistieken (tabel 3) om het gesequenced bibliotheek te waarborgen is geslaagd voor de lab vastgesteld QC metrics (figuur 4). Handmatig controleren elke variant door het bekijken van de .bam bestanden in een genomische data viewer (bijvoorbeeld de Integrative Genomics Viewer 16 (IGV)). OPMERKING: Alleen de varianten binnen de gevalideerde allel-frequentiebereik en boven de minimale diepte van de dekking na de kwaliteit filtering worden gerapporteerd (met behulp van Human Genome Variation Society (vrachtwagens) nomenclatuur). Voor de definitieve rapportage, werd elke exon variant onderverdeeld in: pathogene, waarschijnlijk ziekte geassocieerd, variant van onbekende betekenis (VUS), waarschijnlijk goedaardig, en goedaardige. Alle varianten boven de rapportage criteria van 5% allel frequentie, met uitzondering van die geacht goedaardige varianten en synoniem voor veranderingen, werden gemeld. Figuur 4. Overzicht van kwaliteitscontrole stappen voor NGS. Kwaliteitscontrole van iedere stap in het proces is noodzakelijk om de sequencing resultaten zullen zodanig dat voor en na sequencing metrieken als opbrengst te garanderen. Passende specimen behandeling essentieel voor hoogwaardige DNA. Bloed- enbeenmerg in ongepast fixatieven kunnen lage kwaliteit DNA opleveren. Ongepaste fixatie van vaste tumor specimens kunnen afbreken DNA (bijvoorbeeld fixatie B5). DNA kwaliteit moet worden beoordeeld op eiwitten en RNA besmetting door spectrofotometrische middelen, en nauwkeurig beoordeeld op de hoeveelheid en de integriteit van DNA. De sequentiebepaling metrics moet empirisch worden bepaald in de volgorde laboratorium en gevolgd voor elke sequencing reactie en elk monster. Voorafgaand aan de rapportage van de sequencing resultaten voor elk monster moet worden beoordeeld voor de dekking, diepte en adequate uitvoering van positieve en negatieve controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.