固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

このプロトコルは、それぞれ、固体および液体腫瘍のゲノムプロファイリングのための2つの検証実験室で開発された試験の主要な工程を含みます。実験室で実施したテストは、1988年の臨床検査改善修正法（CLIA）の要件に従って行われます。 末梢血や骨髄から1. DNA抽出 表1に基づいて取るために血や骨髄どの程度を決定します。 サンプル/ WBC 血液1mlのように処理する量骨髄 250μlの血液WBC 12,000 – 50,000 1ミリリットル血液WBC 50,000 – 10万 500μlの血液WBC10万 – 20万 200μlの</ TD> 血液WBC>20万 100μlの *ブラッドWBC <12,000のために、血液の2ミリリットルを取ります 表1：表を使用する血液/骨髄ボリューム白血球数は、サンプルからサ ​​ンプルへ変化するので、使用する血液の特定のボリュームを指定することは困難です。したがって、アッセイに使用する血液の量は、アッセイの前に開始する白血球数（WBC）を見ることによって決定されなければなりません。より少ない血液が利用されているが、依然として存在する細胞の数が通常よりも大きいので、使用される血液の量以来1mlを減少させるかのように扱われるべきです。 ゲノムDNAを単離するための市販のキットのプロトコールに従ってください。 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織から2. DNA抽出に基づく病理学者は、H＆Eスライド上に丸で囲んだ腫瘍領域は、ガイドH＆Eスライドで未染色スライドをラインアップし、抽出のための類似の領域の輪郭を描きます。マクロ解剖のために、プロセスだけ1検体/時のスライドの患者のセット。 少しパラフィンを溶融するために45℃のヒートブロック上でスライドを加熱します。慎重に各試料を抽出するための新しいメスを用いて、スライド上にマークされているライン内の組織をこすり。適切に標識された1.5mlチューブにワックス擦過を置きます。掻き取ったワックスは非常に静電気で、チューブから飛び出す可能性があるので注意してください。 （ – 30μmの合計25）ごとに5μmの5 6へのセクションの脱パラフィンソリューションの320μLを加えます。例えば、10μmのロール/カールの3つのセクションを含むチューブが処理されようとしている場合は、320μLを使用していますが、同じ厚さで5つのセクションが得られたならば、640μLを使用します。 少なくとも10秒間激しくボルテックスし、水溶液を行います組織/側面からワックスやキャップを除去し、溶液中にするために微量にスピンuick。 3分間56℃でインキュベートし、次いで5 RTでインキュベート – 10分。 RTインキュベーション後、追加された脱パラフィンソリューションのすべての320μlのためのATLバッファー180μlを添加します。各試料のための新しい乳棒を用いて無菌ミニ乳棒を用いて組織10回ミンチ。それは非常に粘着することができますように、杵に付着した全く組織が存在しないことを確認してください。渦懸濁液を激しく3秒間、その後1分間最高速度で遠心します。 下の明確な相にプロテイナーゼKの10μLを加えます。組織が再懸濁されていることを確認するために上下にピペッティングにより穏やかに混合。ボルテックスしないでください。 500 rpmの – 400で振盪しながら一晩56℃でインキュベートします。 組織が完全に溶解されている場合は、次の朝は、（下の溶液が透明である場合、このエラーが発生している）を確認します。下の解決策は、foの最大速度で3秒間遠心激しくボルテックス、明確ではない場合R 1分。プロテイナーゼKを10μl、さらに30のために56℃でインキュベート – – 余分5を追加し60分。 ホルムアルデヒド架橋を反転を助けるために1時間90℃でインキュベートします。 10分、その後、簡単に液体を統合する各チューブを遠心分離 – サンプルは5のために室温まで冷却します。 ラベルされた1.5mlチューブに低い明確な相を転送します。 （例えば、複数のロールが使用される場合、場合など）は、同じ患者の検体からの複数のチューブが存在する場合、この時点では一本のチューブに下相を再結合します。注：精製操作を妨害してはならない脱パラフィン液の少量を転送するが、大量に転写される場合、危険性があります。 RNaseを2μlの溶液を加えます。穏やかに攪拌または微量で25回とクイックスピンを反転。室温で5分間インキュベートします。 Protein Precipitation Solutionを200μlのを追加します。一つまたは二つのロールをやっている場合は、200μLを使用しています。 3ロールをやっている場合一度だし、400μLを使用しています。均一に溶解緩衝液を混合する30秒間高速で激しくボルテックス。 5分間氷上でインキュベートまたはサンプルは時間まで氷上に滞在することができます。 5分間、5000×gで遠心分離します。沈殿したタンパク質は、タイト、白ペレットを形成すべきです。ラベルされた1.5mlチューブに上清を注ぎ、その後、少なくとも3分間、氷上でサンプルをインキュベートします。 3分間5000×gで遠心分離します。 Buffer ATLのすべての180μlのために2-プロパノール（イソプロパノール）の200μLを加える（2 mlチューブを使用する必要があるかもしれない）ラベルされた1.5ミリリットルチューブに前に追加しました。例えば、3本ロールをやっている場合は、イソプロパノール600μlを添加します。以前のイソプロパノールに追加されたのBuffer ATLのすべての180μlのためのグリコーゲンの1μlを添加して、混合するためにチューブを数回転倒。 慎重イソプロパノール混合物中にタンパク質沈殿ステップからの上清を追加します。静かに少なくとも50回反転させてチューブを混ぜます。 最大SPでの遠心分離3分間EED。 DNAは、チューブの底に小さな白いペレットとして表示されます。 適切な廃棄物チューブに上清を注ぐまたは吸引します。それが失われたり、他の検体の廃棄物と混合されることはありませんので、ペレットは外れています場合には検体ごと別々1.5ミリリットル廃液チューブを保管してください。ペーパータオル上にチューブを逆さにし、イソプロパノールの大部分が除去されることを確認します。 新たに作製した70％エタノールを300μlを追加します。ペレットを洗浄するために軽く数回チューブを反転。より徹底した清掃を確実にするために追い出されてくるペレットを確保するようにしてください。 5分間、最大速度で遠心します。そしてその後、エタノールを注意深く取り除きます。ペレットが緩んでいるので、ゆっくりと注ぐまたは吸引し、ペレットを見ることができます。ペレットに触れることなく、チューブの内側から過剰のエタノールを除去します。以上のサンプルを乾燥させないように注意しながら、15分 – 5空気乾燥にサンプルを許可します。 電子へのDNA Hydration Solution100μlの – 25との間に追加ACHサンプルDNAペレットの大きさと組織の開始量に基づきます。ボルテックスチューブを激しくかつ簡単に微量でスピン。完全にDNAを再水和するために65℃で1時間インキュベートします。 3.ゲノムDNAの品質管理注：DNAの品質管理（QC）のための3つの独立したステップがあります。各QC工程が行われている理由のさらなる説明については、 表2を参照してください。 楽器結果表示理想的な範囲 DropSense96 A260 / A230 化学汚染物質の識別（ 例えば、エタノール） 1.50から2.2 DropSense96 A260 / A280 タンパク質混入物の同定 1.60から2.2 DropSense96 濃度 DNA定量化 > 1 ngの/μlの TapeStation DNAスミア DNAの完全性の決意（ 例えば 、分解/抽出したDNAの断片化） >千塩基対50％ 量子ビット2.0 濃度より正確なDNA定量 > 1 ngの/μlの 表2：DNA QC予想される結果は、これらの値はすべて、ライブラリの準備段階に進むために、サンプルを許可する実行する前に考慮されます。 製造業者のプロトコルに従って、作業濃度サンプルの濃度（ng /μl）を得るための蛍光光度計に抽出したDNAの2μLを実行します。 サンプルの品質（A260 / A230およびA260 / A280ラットをチェックするために、UV / VIS分光光度計で各2μlのサンプル – 1を実行します。IOS）製造業者の指示に従って。 FFPEサンプルの場合：メーカーの指示に続いて、DNAの分解/断片化を評価するために、マイクロ流体ゲル電気泳動システム上で各試料の1μLを実行します。例については、 図2を参照してください。 図2：ゲノムDNA QCゲルの例は、より低い帯域に渡る緑の線が低いマーカーを示すことです。追加-に赤線が約1,000塩基対を示すことです。 1新鮮なTISのスー （ 例えば 、末梢血または骨髄）から期待通りレーンA2は、完全に無傷のDNAを表します。レーンのB1、C1、D1、B2、C2、E2は良い、無傷のFFPE DNAの例です。レーンF2中のDNAはそのまま、あまりにも低濃度であるように思われます。レーンG2のDNAが分解または断片化され、アッセイでは動作しません。レーンE1、F1、G1、H1、D2、H2は、アッセイがうまく働くかもしれないことを意味する「グレーゾーン」に入るDNAを表しますが、DNAのいくつかは、あまりにも損傷または架橋されたので、それがアッセイでは実行されません可能性があります。 大きいを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。 4.アンプリコンライブラリの準備オリゴプールと結合したオリゴの拡張-ライゲーションのハイブリダイゼーションにも対応する各ゲノムDNAの250 ngの-プレPCRの部屋では、必要な低EDTA TEのボリューム、パネルのオリゴチューブ（ 例えば 、ソリッドNGSパネルまたはヘム-NGSパネル）を5μl、および100を追加ハイブリダイゼーション（HYB）板としてラベルされた半スカート96ウェルプレート。 HYBプレート内の各サンプルにシーケンシング試薬1用のオリゴハイブリダイゼーション（OHS1）の40μLを加えます。混合するために6回 – そっと少なくとも5をピペットと。回避するために、各列の後に変更のヒント交差汚染。 30秒1000×gで接着アルミホイルや遠心分離機でHYBプレートをシール。 1分間95℃で予備加熱したハイブリダイゼーションインキュベーターでHYBプレートをインキュベートします。 40°Cにハイブリダイゼーションインキュベーターの温度を設定します。限り、それは95°Cから40°C（〜90分）に減少するインキュベーターを取るようインキュベートし続けます。注：この段階的な冷却が適切なハイブリダイゼーションのために重要です。 ハイブリダイゼーションのインキュベーションの20分、プレウォッシュフィルタープレートユニット（FPU） – 最後の15の間。現在のアッセイで使用する唯一の井戸を準備し、 すなわち 、唯一の前に開かれたフィルタープレートの新鮮な/未使用井戸を使用していますが、使用されている決して再利用ウェル。注：これは、フィルタープレート上のキット番号、フィルタープレート上のマーキング、およびプレートにまたがって使用シーラントに基づいて明確にする必要があります。 マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルにストリンジェントな洗浄1（SW1）の45μlを添加します。 <br />注意：ホルムアミドが含まれています。 20℃で3分間、2250×gでFPUをカバーし、遠心分離機。残留液ごとに単一のウェルを確認してください（> 15μL/ウェル）。 残留液体が存在する場合は、FPU 180°回転し、さらに3分間、再び遠心分離ステップを繰り返します。残液が二度目を通してスピンした場合、そこにフィルタープレートの欠陥であってもよく、整流板を交換する必要がありますされていない場合、その後、次のステップに進みます。 ハイブリダイゼーションインキュベーターは40℃に冷却した後、凝縮を収集するために20℃で少なくとも30秒間、1000×gでプレートを遠心します。 FPUの対応する予め洗浄したウェルの中心にHYBプレートから各サンプルのボリューム全体を転送します。交差汚染を避けるために、各列の後にヒントを変更します。 20℃で3分間、2250×gでFPUと遠心分離機をカバーしています。 20℃で3分間、2250×gで45 SW1μlの遠心分離機を追加。 2回の洗浄の合計のために繰り返します。完全にすべてのSW1を除去するために、3分間2250×gで再びFPU 180°、遠心分離機を回転させます。 FPUを隠します。適切な廃棄容器に（ホルムアミドを含む）すべてのフロースルーを捨てます。異なるMIDI廃棄物収集プレートを使用してFPUを再度組み立てます。 20℃で3分間、2250×gで各試料ウェルと遠心分離機にユニバーサルバッファ1（UB1）の45μLを加えます。注意：ホルムアミドが含まれています。 FPUプレートおよびピペットアップと混合するダウン3回に各サンプルウェルにエクステンションライゲーションミックス3（ELM3）の45μLを加えます。注：拡張-ライゲーション反応は、フィルタープレートの膜上で行われます。 接着アルミ箔でFPUプレートを密封し、45分間予熱した37℃のインキュベーター中で全体FPUアセンブリをインキュベートします。 インデックス作成およびPCR増幅 インデックスは、インデックス付き増幅PLに対応するウェルに使用されている分量i5のプライマーチューブ（白キャップ、透明な溶液）垂直方向に、Hを介して、行Aと整列し、i7のプライマーチューブ（オレンジキャップ、黄色の溶液）水平方向を次のように配置された指標板の固定具にプライマーを、配置することにより（IAP）を食べました、IAPの各行にi7のプライマー（黄色溶液）の4μlを添加し、IAPの各列にi5のプライマー（透明な溶液）の4μlを添加、P10マルチチャンネルピペットを用いて12を介して列1に整列されます。 氷や冷却ブロックでは、サンプルあたりのPCRマスターミックス2（PMM2）の25μlにDNAポリメラーゼ1（TDP1）の0.5μLを添加することにより、PCRマスターミックスを準備します。簡単に反転、素早くボルテックスし、混合するためにPCRマスターミックスを遠心します。 混合するために、各IAPのウェルとピペットアップにPCRマスターミックスの22μlを添加して、ダウン3回。ウェル間のヒントを変更します。 4℃でIAPを保管してください。 45分間の伸長、ライゲーション反応（ステップ4.1.10）の後、インキュベーターからFPUを削除して、慎重にアルを削除uminumホイルシール。 20℃で3分間、2250×gで蓋と遠心機でカバー。 FPU上の各サンプルウェルに50mMのNaOHを25μlを添加します。アップピペット上下に少なくとも6回。ピペット先端が膜に接触することを確認します。各列の後にヒントを変更します。 5分間、室温でインキュベートします。 次のようにIAPにFPUから溶出転送サンプル。 20μlに設定P100マルチチャンネルピペットを用いて、上下FPUプレート上のピペットのNaOHに少なくとも6回。わずかプレートから完全に吸引を確実にするためにFPUプレートを傾けます。 IAPの対応する列への転送FPUから20μLを。静かにアップピペット上下に少なくとも6回は徹底的にPCRマスターミックスとDNAを結合します。 20℃で1分間の千×gで接着フィルム及び遠心分離機でIAPを封印。 PCR後のルームにPCRプレートを持参し、サーマルサイクラー上でプレートをロードします。 PCR pを実行します。95℃で3分間の工程を熱変性からなるrogram。 30秒、30秒、62℃、60秒間72℃、95℃の25サイクルが続きます。 72℃で5分間の最終伸長が続きます。 10℃で保持して仕上げ。 PCRの完了後に次の段階に進んでいない場合は、プレートを一晩、サーマルサイクラー上に残ることができ、またはそれは二日まで2〜8℃で保存することができます。 PCR精製およびビーズベースの正規化 次の段階の前に少なくとも20分間RTで4℃の冷蔵庫や場所から磁気精製ビーズ、溶出バッファー（EBT）、およびゲル電気泳動試薬を削除します。 PCRが完了した後、20℃で1分間1,000×gで遠心分離は、凝縮を収集します。各PCR反応の転送1μlのサンプル1/5を希釈する水の4μLを含むチューブ/プレートウェルを除去します。アップピペットとミックスダウンします。 2μlのを追加PCRedサンプルは、マイクロ流体 – ゲル緩衝液の2μlに希釈しました。ストリップ/プレートをシール。 30秒1,000×gで、少なくとも30秒間、遠心分離のために1800 rpmで振ります。製造元のプロトコルに続いて、ライブラリの準備が許容ライブラリーが得られた場合（ 図3参照 ） を評価するために、マイクロ流体ゲル上で混合物を実行します。 彼らはよく懸濁しており、色が均一に表示されるまで、磁気精製ビーズをVORTEX。各サンプルにビーズの45μlを添加します。 透明な接着剤フィルムでプレートをシールし、2分間1800 rpmでプレートを振ります。 10分間振盪せずに室温でインキュベートします。 磁気スタンドにプレートを置きます。上清をクリアした後、慎重に取り外し、上清を捨てます。任意のビーズが不注意先端に吸引されている場合は、バックプレートにビーズを分配し、2分間磁石上プレート休みをさせ、上澄みがクリアされたことを確認します。 トン上のプレートと彼磁気スタンドは、各サンプルウェルに、新たに調製した80％エタノールを200μlを追加します。前後に数回プレートを移動します。 30秒間の磁気スタンドにプレートをインキュベートします。慎重に除去し、上清を捨てます。 2回の洗浄の合計のために繰り返します。 簡単に、チューブ側のいずれかのエタノールを引き下げるために千×gでプレートを遠心分離する磁気スタンド上にバックプレートを配置し、エタノールを除去するために、10μlに設定P10のマルチチャンネルピペットを用いて、過剰のエタノールを除去します。 8分 – 5のために空気乾燥にビーズを許可します。 P100マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルにEBTの30μlを添加します。ビーズをチューブの側面をオフに来て確保するようにピペットで数回ダウン。透明な接着剤フィルムでプレートをシールし、2分間1800 rpmでプレートを振ります。 3分間振とうせずに室温でインキュベートします。ビーズを完全に再懸濁されていないサンプルがある場合は、緩やかにビーズを再懸濁するために上下にピペット。 磁気スタンドにプレートを置きます。 P100マルチチャンネルピペットを用いて、全く新しいプレートに20μlの上清を転送するには、ライブラリの正規化プレート（LNP）と呼ばれます。別のプレートに、個々のシーケンシングライブラリの残り〜10μLを転写残クリーンアップ図書館プレート（RCLP）と呼ばれます。必要であれば、それは、第二の配列決定の実行のための予備として使用することができるように、最終的なライブラリの準備と一緒に、このプレートを保管してください。次のステージに移行しない場合は、LNPとRCLPは-15〜-25℃で保存することができます。 激しくボルテックスし、図書館正規化ビーズ1（LNB1）を再懸濁します。完全にチューブの底にLNB1ビーズペレットを再懸濁することが重要です。サンプルあたりライブラリ正規化添加剤1の44μlの（LNA1）とLNB1の8μLを混合することにより、正規化ミックスを準備します。 20秒 – 勢いよく10のための正規化ミックスをボルテックス。 注意：LNA1は、ホルムアミドが含まれています。 断続的な反転AでND正規ミックスのボルテックス、LNPの各サンプルに45μlを添加します。透明な接着剤フィルムでプレートをシールし、30分間1,800 rpmでプレートを振ります。この30分間のインキュベーションは、ライブラリの表現とクラスタ密度に影響を与える可能性が大きいか小さいよりも30分のインキュベーションとして適切なライブラリの正規化のために重要です。 30分間のインキュベーションの間に、試薬カートリッジを解凍し、Hybをバッファ（HT1）によって配列決定のための試薬を準備する[注意：どちらも、ホルムアミドを含めます]。また、後工程のための氷を取得し、1.5ミリリットルの遠心分離管に適したヒートブロックを96℃に設定されていることを確認。 30分混合工程が完了すると、磁気スタンドにLNPを置きます。上清をクリアした後、慎重に取り外し、適切な廃棄容器に上清を廃棄し、マルチチャンネルピペットを使用しています。 次のようにライブラリの正規ウォッシュ1（LNW1）でビーズを磁気スタンドからLNPを取り外し、洗浄： 45を追加します。各サンプルウェルにLNW1μlの。 注意：ホルムアミドが含まれています。透明な接着剤フィルムでプレートをシールし、5分間1,800 rpmでプレートを振ります。 2回の洗浄の合計のために繰り返します。第二の洗浄後にすべてのLNW1を削除することを確認します。 磁気スタンドからLNPを削除し、マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルを溶出させるために各ウェルに0.1NのNaOH（旧週未満）の30μlを添加します。透明な接着剤フィルムでプレートをシールし、5分間1,800 rpmでプレートを振ります。 5分間の溶出中、保管プレート（SGP）という名前の新しいプレートに使用されるように各ウェルにライブラリの正規化ストレージバッファ1（LNS1）の30μlを添加します。 磁気スタンドにLNPを置きます。上清をクリアしたら、SGPにLNS1に30μlの溶出を転送します。交差汚染を避けるために、サンプル間のヒントを変更します。 少なくとも30秒間千×gで接着フィルム及び遠心分離機でプレートをシール。 5を追加します。1;各サンプルのリットルは、標識したプールされたアンプリコンライブラリ（PAL）を1.5 mlチューブに配列決定されます。混ぜると簡単に微量にスピンダウンするPALをVORTEX。 HT1の596μlの – 590 PAL10μlの – 使用されているものをシークエンシング化学（V2またはV3）に応じて、4を追加します。一般的に、V3化学のためHT1の592μlにV2化学とPALの8.5μlのためのHT1の595μlにPALの5.8μlを添加します。希薄化後アンプリコンライブラリ（DAL）チューブとしてこのチューブにラベルを付けます。 DALをボルテックスし、短時間微量でスピンダウン。 2分間96℃でDALをインキュベートします。 DALチューブを3回反転し、配列決定のためのシーケンサを準備している間、少なくとも5分間氷上にDALを置きます。 5分後、DALをロードする準備ができました。 SGPで仕上げた場合、接着剤アルミ箔フィルムでプレートをシールし、日付とプレートのIDとラベルを付けます。 -15 -25℃で密封しSGPとPALを保管してください。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-ページ= "1"> 図3：ライブラリ準備QCジェル例が低い帯域に渡る緑の線が下マーカーおよび上部バンドの上に紫色のラインを示すことで、より高いマーカーを示すことです。すべてがレーンH1、A2、B2、C2、E2、およびG2のためによく働きました。ライブラリの準備はレーンD2、F2、およびH2のために、最適に動作しませんでしたが、結果はまだ彼らはちょうど十分なカバレッジを持っていない可能性があり得ます。 A3の場合は、ライブラリの準備はほとんど働いていた可能性が最も高い、このDNAサンプルをアッセイに十分ではありませんでした。アリコートをよくPCRedから直接取得されるので、下のマーカー上記の低いバンドは、未使用のプライマーです。 NTCサンプルのみ未使用のプライマーのバンド、と他には何を持っている必要があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 5.シーケンシング正しいSampleSheet.csvは、実行のために作られていることを確認します。例えば補足図1を参照してください。 すすぎと乾燥フローセルを解凍試薬カートリッジにDALの600μlを添加します。 画面の指示に従うことにより、配列決定のためのシーケンサを準備します。 6.データ解析バイオインフォマティクスパイプラインを実行します。突然変異、挿入、欠失および増幅18を識別するために、社内、カスタム設計されたバイオインフォマティクスパイプラインを利用しています。 パイプラインが完了した後、パイプライン処理のQCのいずれかの重大なエラー/警告助剤として、エラー/警告のログファイルを確認してください。 配列を決定し、ライブラリを確実にするために、実行統計（ 表3）を分析経過したラボでは、QCメトリック（ 図4）を決定しました。手動ゲノムデータビューワ（ 例えば 、統合ゲノミクスViには.bamファイルを表示して、各バリアントを見直します水差し16（IGV））。 注：品質のフィルタリング後の検証アレル周波数範囲内とカバレッジの最小深上記のみの変異体は、（ヒトゲノムバリエーション協会の（HGVS）命名法を使用して）報告されています。おそらく良性、および良性、未知の重要性の病原性、おそらく疾患関連、バリアント（VUS）：最終報告のために、各エクソンの変異体はに分類しました。 5％の対立遺伝子頻度の報告基準上記の全ての変異体は、それらとみなさ良性変種と同義の変化を除いて、報告されました。 NGSための品質管理手順を図4概要プロセスの各ステップの品質管理は、前後配列決定メトリックが考慮されるような結果が得られるシーケンシングを確保する必要があります。適切な試料の処理は、高品質のDNAのために不可欠です。血と不適切な固定剤での骨髄は低品質のDNAを得ることができます。固形腫瘍標本の不適切な固定は、DNA（B5で例えば 、固定）を低下させることができます。 DNAの品質は分光光度手段によりタンパク質やRNA汚染について評価し、かつ正確にDNAの量および完全性について評価すべきです。シークエンシングのメトリックは、経験的にシーケンシング実験室で決定され、各配列決定反応、すべての検体について追跡する必要があります。各検体のための配列決定の結果を報告する前には、カバレッジ、深さ、陽性および陰性対照の適切なパフォーマンスのために評価されるべきである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。