Le séquençage de prochaine génération pour la détection des Actionable mutations dans les tumeurs solides et liquides

Ce protocole comprend les étapes saillantes de deux essais en laboratoire développé validées pour le profilage génomique des tumeurs solides et liquides, respectivement. Les tests effectués dans le laboratoire se fait en conformité avec les exigences des cliniques Modifications de l'amélioration des laboratoires (CLIA) de 1988. 1. Extraction de l'ADN à partir du sang périphérique ou de moelle osseuse Déterminer la quantité de sang ou de moelle osseuse à prendre basé sur le tableau 1. Sample / WBC Montant à être traité comme 1 ml de sang Moelle osseuse 250 ul WBC Blood 12,000 – 50,000 1 ml WBC Blood 50,000 – 100,000 500 ul WBC Blood 100 000 – 200 000 200 ul </ Td> WBC Blood> 200000 100 ul * For Blood WBC <12.000, prendre 2 ml de sang Tableau 1:. Sang / Bone Marrow Volume pour utiliser Graphique Depuis le sang numération des globules blancs varie d' un échantillon à l'autre , il est difficile de spécifier un volume spécifique de sang à utiliser. Par conséquent, la quantité de sang à utiliser pour le dosage doit être déterminée en examinant le nombre de globules blancs du sang (WBC) avant de commencer l'essai. Bien que moins de sang est utilisé, il devrait encore être traitée comme si ses 1 ml depuis le volume de sang utilisé est réduite parce que le nombre de cellules présentes est supérieure à la normale. Suivre le protocole du kit disponible dans le commerce pour isoler l'ADN génomique. 2. Extraction de l'ADN de paraffine (FFPE) tissus fixés au formol Basé surrégion de la tumeur le pathologiste encerclé sur la diapositive H & E, aligner les lames non colorées avec le guide H & E diapositive et définir une zone similaire pour l'extraction. Pour macro-dissection, processus qu'un seul spécimen / l'ensemble des patients de diapositives à la fois. Chauffer les lames sur un bloc C de chaleur de 45 ° pour faire fondre légèrement la paraffine. racler délicatement le tissu dans les lignes qui sont marquées sur la diapositive, en utilisant un nouveau scalpel pour chaque échantillon à extraire. Placez les raclures de cire dans le tube de 1,5 ml étiquetés de manière appropriée. Soyez prudent parce que la cire est très éraflé électrostatique et peut sauter hors du tube. Ajouter 320 pi de déparaffinage Solution pour tous les cinq à six 5 um sections (25 – 30 um au total). Par exemple, si un tube contenant 3 sections de 10 um rouleau / boucle va être traitée, puis utiliser 320 pi, mais si 5 sections à la même épaisseur ont été obtenus alors utiliser 640 pi. Vortexer vigoureusement pendant au moins 10 secondes et d'effectuer aqrotation uick dans une microcentrifugeuse pour éliminer le tissu / la cire sur les côtés et capuchon et dans la solution. Incuber à 56 ° C pendant 3 min, puis on incube à la température ambiante pendant 5 -. 10 min. Après l'incubation température ambiante, ajouter 180 ul de tampon ATL pour chaque 320 pi de solution a été ajoutée déparaffinage. Émincer le tissu dix fois l'aide d'un mini-pilon stérile en utilisant un nouveau pilon pour chaque échantillon. Assurez-vous qu'il n'y a pas de tissu collé à pilon, car il peut être très collant. Vortex la suspension vigoureusement pendant 3 secondes, puis centrifuger à vitesse maximale pendant 1 min. Ajouter 10 pl de Proteinase K à la phase claire inférieure. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas pour assurer le tissu est remis en suspension. NE PAS vortex. Incuber à 56 ° C pendant une nuit sous agitation à 400-500 tours par minute. Le lendemain matin, vérifier si le tissu est complètement dissous (ce qui a eu lieu si la solution inférieure est clair). Si la solution inférieure est pas claire, puis vortex vigoureusement pendant 3 secondes et centrifuger à vitesse maximale for 1 min. Ajoutez un 5 supplémentaire – 10 pl de Proteinase K et incuber à 56 ° C pendant encore 30 – 60 min. Incuber à 90 ° C pendant 1 heure pour aider à inverser le formaldehyde réticulation. Laisser les échantillons refroidir à la température ambiante pendant 5 à 10 min, puis centrifuger brièvement chaque tube pour consolider le liquide. Transférer la phase claire inférieure dans un tube de 1,5 ml étiqueté. Si plusieurs tubes du même échantillon de patient (comme le cas si plusieurs rouleaux sont utilisés), recombiner les phases inférieures dans un tube à ce point. Remarque: Le transfert de petites quantités de la solution Déparaffinage ne devrait pas interférer avec la procédure de purification, mais il y a un risque si une grande quantité est transférée. Ajouter 2 pl de RNase A solution. Vortex doucement ou inverser 25 fois et tour rapide dans une microcentrifugeuse. Incubation à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 200 pi de solution de protéines de précipitation. Si faire un ou deux rouleaux, utiliser 200 pi. Si vous le faites à trois rouleauxs à la fois, puis utiliser 400 pi. Vortex vigoureusement à grande vitesse pendant 30 secondes pour mélanger uniformément les tampons de lyse. Incuber sur la glace pendant 5 min ou les échantillons peuvent rester sur la glace jusqu'à une heure. Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min. La protéine précipitée doit former, une pastille blanche serrée. Verser le surnageant dans un tube de 1,5 ml marqué, et ensuite incuber les échantillons sur de la glace pendant au moins 3 min. Centrifuger à 5000 xg pendant 3 min. Ajouter 200 pi de 2-propanol (alcool isopropylique) pour 180 ul de tampon ATL ajoutés précédemment à un tube de 1,5 ml marqué (il peut être nécessaire d'utiliser un tube de 2 ml). Par exemple, si trois rouleaux faisant ajouter 600 ul d'isopropanol. Ajouter 1 pl de glycogène pour chaque 180 pi de tampon ATL ajouté précédemment à l'isopropanol et inverser le tube plusieurs fois pour mélanger. ajouter délicatement le surnageant de l'étape Protein de précipitation dans le mélange Isopropanol. Mélanger le tube en retournant doucement au moins 50 fois. Centrifugeuse à un maximum speed pendant 3 min. L'ADN sera visible en tant que petite pastille blanche au fond du tube. Verser ou aspirer le surnageant dans le tube de récupération approprié. Gardez un tube de 1,5 ml de déchets séparés pour chaque échantillon dans le cas où le culot vient délogé de sorte qu'il ne sera pas perdu ou mélangé avec les déchets d'autres spécimens. Égoutter le tube sur une serviette en papier et assurez la majorité de la Isopropanol est supprimée. Ajouter 300 ul de fraîchement préparé 70% d'éthanol. Inversez doucement le tube plusieurs fois pour laver le culot. Essayez de vous assurer le culot vient délogé pour assurer un nettoyage plus approfondi. Centrifugeuse à vitesse maximale pendant 5 min. puis retirez soigneusement l'éthanol. Le culot peut être lâche, donc verser ou aspirez lentement et regarder le culot. Éliminer l'excès d'éthanol à partir de l'intérieur du tube, sans toucher à la pastille. Laisser les échantillons sécher à l'air pendant 5 – 15 min, en prenant soin de ne pas trop sécher l'échantillon. Ajouter entre 25-100 ul d'Hydratation Solution ADN pour ehaque échantillon en fonction de la taille du culot d'ADN et de la quantité de départ de tissu. Vortex les tubes vigoureusement et rapidement tourner dans une microcentrifugeuse. Incuber pendant 1 heure à 65 ° C pour réhydrater complètement l'ADN. 3. Contrôle de la qualité de l'ADN génomique Remarque: Il y a trois étapes indépendantes pour le contrôle de la qualité de l'ADN (QC). Voir le tableau 2 pour plus d' explications sur la raison pour laquelle chaque étape de QC est effectuée. Instrument Résultat Indication Plage idéale DropSense96 A260 / A230 Identification des contaminants chimiques (par exemple, l' éthanol) 1,50 à 2,2 DropSense96 A260 / A280 Identification des contaminants protéiques 1,60 à 2,2 DropSense96 La concentration quantification de l'ADN > 1 ng / ul TapeStation ADN Smear Détermination de l' intégrité de l' ADN (par exemple, la dégradation / fragmentation de l' ADN extrait) 50%> 1000 pb Qubit 2.0 La concentration Plus précise la quantification de l'ADN > 1 ng / ul Tableau 2:. ADN QC Résultats attendus Toutes ces valeurs sont prises en compte avant d' exécuter un échantillon permettant de procéder à la phase de préparation de la bibliothèque. En suivant le protocole du fabricant, l'essai 2 ul de l'ADN extrait sur un fluoromètre pour obtenir la concentration de travail (ng / ul) de l'échantillon. Exécutez 1 – 2 pi de chaque échantillon sur un spectrophotomètre UV / VIS pour vérifier la qualité de l'échantillon (A260 / A230 et A260 / A280 ratios) selon les instructions du fabricant. Pour les échantillons FFPE: A la suite des instructions du fabricant, exécutez 1 pl de chaque échantillon sur un système d'électrophorèse sur gel microfluidique pour évaluer la dégradation / fragmentation de l'ADN. Voir la Figure 2 pour les exemples. Figure 2:. L' ADN génomique QC Gel Exemple La ligne verte sur les bandes inférieures est d'indiquer le marqueur inférieur. La ligne rouge ajoutée en est d'indiquer environ 1000 pb. Lane A2 représente l' ADN intact, comme on pouvait s'y attendre de la part sue tis frais (par exemple, du sang périphérique ou de moelle osseuse). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 sont des exemples de bonne ADN FFPE, intact. L'ADN dans la voie F2 semble être intact, mais à une concentration trop faible. L'ADN dans la voie G2 est dégradé ou fragmenté et ne fonctionnera pas dans le dosage. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 représentent l' ADN qui tombe dans la «zone grise» qui signifie que le test pourrait bien fonctionner, mais une partie de l'ADN pourrait être trop endommagé ou réticulé et donc il ne fonctionnera pas bien dans le test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre. 4. Bibliothèque amplicon Préparation Hybridation de Oligo Pool and Extension-Ligation des oligos Bound Dans la salle de pré-PCR, ajouter le volume nécessaire de Low EDTA TE, 5 pi de Oligo Tube du Groupe spécial (par exemple, Solid-NGS Panel ou Heme-NGS Panel), et 100-250 ng d'ADN génomique à chaque correspondant bien une 96 bien-plaque de semi-jupe étiqueté comme le (HYB) plaque hybridation. Ajouter 40 ul d'Oligo Hybridation pour le séquençage de réactif 1 (OHS1) pour chaque échantillon dans la plaque HYB. pipette doucement vers le haut et vers le bas au moins 5 – 6 fois pour mélanger. Modifier conseils après chaque colonne pour éviterla contamination croisée. Sceller la plaque HYB avec une feuille d'aluminium adhésive et centrifuger à 1000 g pendant 30 sec. Incuber la plaque HYB dans l'incubateur d'hybridation préchauffé à 95 ° C pendant 1 min. Régler la température de l'incubateur d'hybridation à 40 ° C. Continuer à faire incuber aussi longtemps qu'il faut diminuer l'incubateur à 95 ° C à 40 ° C (~ 90 min). Remarque: Ce refroidissement progressif est essentiel pour une hybridation correcte. Pendant les 15 dernières – 20 min de l'incubation d'hybridation, pré-laver l'unité filtre à plaques (FPU). Préparer seulement les puits pour être utilisés dans l'essai en cours, à savoir, utiliser uniquement des puits frais / inutilisés d'une plaque de filtre précédemment ouvert, mais jamais réutiliser les puits qui ont été utilisés. Note: Ceci doit être clair sur la base du kit Nombre sur la plaque de filtre, les marquages ​​sur la plaque de filtre, et le mastic utilisé à travers la plaque. En utilisant une pipette à canaux multiples, ajouter 45 pl de lavage stringent 1 (SW1) à chaque puits. <br /> ATTENTION: formamide Contient. Couvrir et centrifuger la FPU à 2.250 xg pendant 3 min à 20 ° C. Vérifiez chaque puits unique pour le liquide résiduel (> 15 pl / puits). Si le liquide résiduel existe, tourner la FPU 180 ° et répétez l'étape de centrifugation à nouveau pendant 3 minutes supplémentaires. Si le liquide résiduel tourne à travers la deuxième fois, puis passez à l'étape suivante, sinon il peut y avoir un défaut dans la plaque de filtre et la plaque actuelle devra être remplacé. Une fois que l'incubateur d'hybridation a refroidi à 40 ° C, de centrifuger la plaque à 1000 x g pendant au moins 30 secondes à 20 ° C pour recueillir la condensation. Transférer la totalité du volume de chaque échantillon de la plaque HYB sur le centre du puits prélavés correspondants de la FPU. Modifier conseils après chaque colonne pour éviter la contamination croisée. Couvrir le FPU et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C. Ajouter 45 ul de SW1 et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C. Répétez l'opération pour un total de deux lavages. Tournez la FPU 180 ° et centrifuger à nouveau à 2.250 xg pendant 3 min pour éliminer complètement tous les SW1. Désassembler le FPU. Jeter toutes les actions accréditives (contenant du formamide) dans le conteneur à déchets approprié. Remontez le FPU en utilisant une autre plaque MIDI Collection des déchets. Ajouter 45 pi de tampon universel 1 (UB1) pour chaque échantillon et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C. ATTENTION: formamide Contient. Ajouter 45 ul d'extension Ligation Mix 3 (ELM3) pour chaque échantillon sur la plaque de FPU et la pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger. Remarque: La réaction d'extension-ligature a lieu sur la membrane de la plaque filtrante. Sceller la plaque FPU avec une feuille d'aluminium adhésif et incuber l'ensemble de FPU ensemble dans un pré-chauffé à 37 ° C incubateur pendant 45 min. Indexation et Amplification PCR Aliquote les indices utilisés pour les puits correspondants dans le Répertorié Amplification Plate (IAP) en disposant les amorces dans le Fixture Indice de plaque, disposées de la manière suivante: tubes d'amorces i5 (bonnets blancs, solution limpide) verticalement, alignés avec des rangées A à H, tubes d'amorces i7 (les bouchons orange, solution jaune) horizontalement , aligné avec les colonnes 1 à 12. Utilisation d'un multi-canal pipette p10, ajouter 4 pi d'amorces i7 (solution jaune) à chaque rangée du PEI et ajouter 4 pi d'amorces i5 (solution limpide) pour chaque colonne du PEI. Sur la glace ou un bloc de refroidissement, préparer le PCR Master Mix en ajoutant 0,5 pi de l'ADN Polymerase 1 (PCSRA1) à 25 pl de PCR Master Mix 2 (PMM2) par échantillon. Inverser, rapidement vortex et centrifuger brièvement le PCR Master Mix pour mélanger. Ajouter 22 ul de la PCR Master Mix à chaque puits de l'IAP et la pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger. Changer conseils entre les puits. Gardez l'IAP à 4 ° C. Après 45 min Extension-Ligation réaction (étape 4.1.10), retirer la FPU de l'incubateur et retirez soigneusement le aluminum opercule en aluminium. Couvrir avec le couvercle et centrifuger à 2250 xg pendant 3 min à 20 ° C. Ajouter 25 pi de NaOH 50 mM à chaque puits d'échantillon sur la FPU. Pipeter haut et en bas au moins 6 fois; assurer que les pointes de pipette entrer en contact avec la membrane. Modifier conseils après chaque colonne. Incuber à température ambiante pendant 5 min. échantillons de transfert élues de la FPU au PEI comme suit: En utilisant une pipette multi-canal p100 réglé sur 20 pi, pipetter le NaOH sur la plaque de FPU monter et descendre au moins 6 fois. Inclinez légèrement la plaque de FPU pour assurer l'aspiration complète de la plaque. Transférer 20 ul de la FPU à la colonne correspondante de l'IAP. pipeter doucement vers le haut et vers le bas au moins 6 fois pour bien mélanger l'ADN avec le PCR Master Mix. Sceller le PEI avec un film adhésif et centrifuger à 1000 g pendant 1 min à 20 ° C. Apportez la plaque PCR dans la chambre post-PCR et charger la plaque sur un cycleur thermique. Exécutez le p PCRROGRAM consistant en une étape de chauffage à 95 ° C pendant 3 min dénaturant; suivie par 25 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 62 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 60 secondes; suivie d'une extension finale de 72 ° C pendant 5 min; finition avec un maintien à 10 ° C. Si ne pas procéder à l'étape suivante après l'achèvement de la PCR, la plaque peut rester sur le cycleur thermique pendant la nuit, ou il peut être stocké entre 2 et 8 ° C jusqu'à deux jours. Purification PCR et Normalization Bead-Based Retirer les perles de purification magnétiques, Elution Buffer (EBT), et réactifs gel électrophorèse à partir de la 4 ° C réfrigérateur et lieu à température ambiante au moins 20 minutes avant l'étape suivante. Une fois que la PCR est terminée, centrifuger à 1000 g pendant 1 min à 20 ° C pour recueillir la condensation. Transfert 1 pl de chaque réaction PCR à dépouillent tubes / puits de plaques contenant 4 ul d'eau pour diluer les échantillons 1/5. Pipeter haut et en bas pour mélanger. Ajouter 2 ul de laéchantillons dilués PCRed à 2 pi de tampon microfluidique-gel. Sceller les bandes / plaque. Agiter à 1800 rpm pendant au moins 30 secondes et centrifuger à 1000 xg pendant 30 sec. Après le protocole du fabricant, exécutez le mélange sur un gel microfluidique pour évaluer si la préparation de la bibliothèque a abouti à une bibliothèque acceptable (voir Figure 3). Vortex les perles de purification magnétiques jusqu'à ce qu'ils soient bien suspendus et la couleur apparaît homogène. Ajouter 45 ul des billes à chaque échantillon. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 2 min. Incuber à température ambiante, sans agitation pendant 10 min. Placer la plaque sur un support magnétique. Une fois que le surnageant a autorisé, soigneusement retirer et jeter le surnageant. Si toutes les billes sont aspirés par inadvertance dans les conseils, distribuer les perles de retour à la plaque et laisser la plaque d'appui sur l'aimant pendant 2 minutes et confirmer que le surnageant a été compensé. Avec la plaque sur til support magnétique, ajouter 200 pi de fraîchement préparé 80% d'éthanol pour chaque échantillon. Déplacer la plaque avant et en arrière à quelques reprises. Incuber la plaque sur le support magnétique pendant 30 sec. Retirez délicatement et jeter le surnageant. Répétez l'opération pour un total de deux lavages. Retirer l'excès d'éthanol par centrifugation brièvement la plaque à 1000 xg pour faire baisser toute l'éthanol sur les côtés du tube, en plaçant la plaque arrière sur le support magnétique, et à l'aide d'une pipette p10 multi-canal réglé sur 10 pi pour éliminer l'éthanol. Autoriser les perles à l'air libre pendant 5-8 min. En utilisant une pipette à canaux multiples p100, ajouter 30 ul de BAI à chaque puits. Pipeter haut et en bas quelques fois pour assurer les perles viennent sur le côté du tube. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 2 min. Incuber à température ambiante sans agitation pendant 3 min. S'il y a des échantillons dans lesquels les perles ne sont pas complètement remises en suspension, pipette doucement monter et descendre pour remettre en suspension les perles. Placer la plaque sur un support magnétique. En utilisant une pipette multi-canaux p100, transférer 20 pi du surnageant à une toute nouvelle plaque appelée plaque Bibliothèque Normalization (TNL). Transférer les 10 pi restants ~ des bibliothèques de séquençage individuelles à une plaque séparée appelée restante Nettoyé-Up Library Plate (RCLP). Conservez cette plaque avec la bibliothèque de préparation finale, car il peut être utilisé comme une réserve pour une deuxième manche de séquençage, le cas échéant. Sinon passer à l'étape suivante, la LNP et RCLP peuvent être stockés à -15 à -25 ° C. Vigoureusement vortex et resuspendre la Bibliothèque Normalization Perles 1 (LNB1). Il est essentiel pour remettre en suspension le culot complètement LNB1 de talon au fond du tube. Préparer la normalisation Mix, en mélangeant 8 pi de LNB1 avec 44 pi de bibliothèque Normalization additifs 1 (LNA1) par échantillon. Vigoureusement vortex le Normalization Mix pour 10 – 20 sec. ATTENTION: LNA1 contient formamide. Avec intermittente inversion unee tourbillonnement du mélange de normalisation, ajouter 45 ul de chaque échantillon de la TNL. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 30 min. Cette incubation de 30 minutes est indispensable pour la normalisation de la bibliothèque appropriée en tant que incubations de plus ou moins 30 minutes peuvent influer sur la représentation bibliothèque et la densité de la grappe. Pendant les 30 minutes d'incubation, préparer les réactifs pour le séquençage par décongélation de la cartouche de réactif et le tampon Hyb (en HT1) [MISE EN GARDE: Les deux contiennent du formamide]. En outre, obtenir de la glace pour une étape ultérieure et d'assurer un bloc thermique approprié pour tubes de 1,5 ml de centrifugeuse est réglé à 96 ° C. Lorsque l'étape de mélange de 30 min est terminée, placez le TNL sur un support magnétique. Une fois que le surnageant a autorisé, utiliser une pipette multi-canal pour enlever soigneusement et jeter le surnageant dans le conteneur de déchets. Retirez la LNP du support magnétique et laver les billes avec Bibliothèque Normalization Wash 1 (LNW1) comme suit: Ajouter 45pi de LNW1 à chaque échantillon. ATTENTION: formamide Contient. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 5 min. Répétez l'opération pour un total de deux lavages. Assurez-vous de supprimer tous les LNW1 après le second lavage. Retirer la LNP du support magnétique et, à l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 30 pl de NaOH 0,1 N (moins d'une semaine) dans chaque puits pour éluer l'échantillon. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent et agiter la plaque à 1800 rpm pendant 5 min. Au cours de la 5 min élution, ajouter 30 pi de tampon de stockage Bibliothèque Normalization 1 (LNS1) à chaque puits pour être utilisé dans une nouvelle plaque nommée la plaque de stockage (SGP). Placez le TNL sur le support magnétique. Une fois que le surnageant a autorisé, transférer l'élution de 30 ul du LNS1 dans le PSC. Changer des conseils entre les échantillons afin d'éviter la contamination croisée. Sceller la plaque avec un film adhésif et centrifuger à 1000 g pendant au moins 30 secondes. Ajouter 51, l de chaque échantillon à sequencer à un Pooled amplicon marqué bibliothèque (PAL) du tube de 1,5 ml. Vortex PAL pour mélanger et brièvement centrifuger dans une microcentrifugeuse. En fonction de ce que la chimie de séquençage utilisée (V2 ou V3), ajouter 4 – 10 pi de PAL à 590 – 596 ul de HT1. En général, ajouter 5,8 pi de PAL à 595 pi de HT1 pour la chimie de V2 et 8,5 pi de PAL à 592 pi de HT1 pour la chimie V3. Nommez ce tube comme l'amplicon Library (DAL) Tube dilué. Vortex du DAL et brièvement centrifuger dans une microcentrifugeuse. Incuber la DAL à 96 ° C pendant 2 min. Inverser le tube DAL 3 fois et mettre le DAL sur la glace pendant au moins 5 min, tout en préparant le séquenceur pour le séquençage. Après les 5 minutes, le DAL est prêt à être chargé. Si vous avez terminé avec le PSC, sceller la plaque avec un film de feuille adhésive en aluminium et l'étiqueter avec la date et la plaque d'identité. Stocker le SGP scellé et PAL à -15 à -25 ° C. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figure 3:. Library Prep QC Gel Exemple La ligne verte sur les bandes inférieures est d'indiquer le marqueur inférieur et la ligne violette sur les bandes supérieures est d'indiquer le marqueur supérieur. Tout a bien fonctionné pour les voies H1, A2, B2, C2, E2, et G2. La bibliothèque de préparation ne fonctionnait pas de manière optimale, pour les voies D2, F2 et H2, mais les résultats seront encore obtenus ils pourraient ne pas avoir une couverture adéquate. Pour A3, la bibliothèque prep marchait à peine et très probablement cet échantillon d'ADN n'a pas été suffisante pour le dosage. Les bandes inférieures au-dessus du marqueur inférieur sont les amorces non utilisées, parce que la partie aliquote est prélevée directement du PCRed bien. L'échantillon NTC ne devrait avoir la bande d'apprêt utilisé, et rien d' autre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 5. séquençage Assurer une SampleSheet.csv correcte a été faite pour la course. Voir Figure 1 supplémentaire pour un exemple. Rincer et sécher la cellule d'écoulement et ajouter 600 ul de la DAL à la cartouche de réactif décongelé. Préparer le séquenceur pour le séquençage en suivant les instructions à l'écran. Analyse 6. Données Exécutez le pipeline bioinformatique. Utiliser le pipeline bioinformatique en interne, conçu sur mesure pour identifier des mutations, des insertions, délétions et amplifications 18. Après le pipeline terminé, vérifiez les fichiers journaux d'erreurs / avertissement, comme toute aide significative erreurs / avertissements dans le QC du traitement de pipeline. Analyser les statistiques d'exécution (tableau 3) pour assurer la bibliothèque séquencée a passé le laboratoire déterminé QC métriques (Figure 4). Examiner manuellement chaque variante en consultant les fichiers .bam dans un visualiseur de données génomiques (par exemple, la génomique intégrative Viaiguière 16 (IGV)). NOTE: Seules les variantes dans la gamme allèle-fréquence validé et au-dessus de la profondeur minimum de couverture après le filtrage de la qualité sont rapportés (en utilisant (poids lourds) la nomenclature de Human Genome Variation Society). Pour le rapport final, chaque variante exonique a été classé en: pathogène, probablement une maladie associée, variante de signification inconnue (VUS), probablement bénigne, et bénigne. Toutes les variantes ci-dessus les critères de déclaration de 5% la fréquence des allèles, à l'exception de ces variantes bénignes réputés et des changements synonymes, ont été signalés. Figure 4. Présentation des étapes de contrôle de la qualité pour NGS. Contrôle de la qualité de chaque étape du processus est nécessaire pour assurer le séquençage donnera des résultats tels que les paramètres pré et post séquençage sont considérés. le traitement de l'échantillon approprié est essentiel pour l'ADN de haute qualité. sang etla moelle osseuse dans des fixateurs inappropriés peut produire l'ADN de faible qualité. Fixation inappropriée des échantillons de tumeurs solides peut dégrader l' ADN (par exemple, la fixation dans B5). la qualité de l'ADN devrait être évaluée pour les protéines et la contamination de l'ARN par spectrophotométrie et évalué avec précision le montant et l'intégrité de l'ADN. Les mesures de séquençage doivent être déterminées de manière empirique dans le laboratoire de mise en séquence et ensuite pour chaque réaction de séquençage et chaque échantillon. Avant la présentation des résultats de séquençage pour chaque échantillon doit être évalué pour la couverture, la profondeur et la performance adéquate des contrôles positifs et négatifs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.