Summary

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Published: July 30, 2015
doi:

Summary

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Abstract

Intra-timik T hücre gelişimi, çeşitli stromal hücrelerin, yani olmayan T hücrelerden oluşan karmaşık bir üç boyutlu ağ örgüsü gerektirir. Sırayla, yani T hücre reseptör repertuarı oluşturma ve seçim ardından T hücre soyu taahhüt önce çevre içine ihracat, zorunlu kontrol noktaları geçerken timositleri son derece koordineli zamansal ve mekansal için bu iskelesi travers. Bu iskele oluşturan iki ana yerleşik hücre tipleri (cTECs) kortikal ve medüller timik epitel hücreleri (mTECs) bulunmaktadır. MTECs önemli bir özelliği, bir çok dokuya sınırlı bir antijenlerin olarak adlandırılan rasgele ifadesidir. Bu dokuya sınırlı antijenler, sırasıyla kendi kendine tolerans sonuçlanan mTECs ya timik dendritik hücreler tarafından doğrudan veya dolaylı olarak timositleri olgunlaşmamış sunulmaktadır.

CTECs ve mTECs gelişim yollarını ve fonksiyonlarını taklit in vitro uygun modeller şu anda lak vardırkral. Yeterli deneysel modellerin eksikliği, örneğin hala tam olarak hücresel ve moleküler düzeyde anlaşılmaktadır karışık gen ifadesinin, analiz engelliyordu. Biz ex vivo izole mTECs kültürüne 3D organotipik ko-kültür modeli uyarladı. Bu model, ilk olarak in vitro olarak, bir cilt eşdeğer üretmek üzere bir şekilde keratinosit yetiştirmek için geliştirilmiştir. , CD80 hi, Aire-pozitif mTECs, RANKL (ii) tepki ve FoxN1 (iii) sürekli ifadeye (i) çoğalması ve CD80 lo, Aire-negatif terminal farklılaşma: 3D model mtec biyoloji temel fonksiyonel özellikler korunmuş Aire ve CD80 hi mTECs doku kısıtlı genler.

Introduction

Geri kalan% 2 toplu timik stroma oluşturan çeşitli hücreler oluşur ise geliştirilmesi timositleri, timüs yaklaşık% 98 kadar olmak (yani, epitel hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar, B hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri). Dış kortikal epitel hücreleri (cTECs) multipotent öncesi T hücreleri ve öz-MHC olumlu seçiminde kemik iliği, T hücre soyu indüksiyon yanlısı T hücrelerinin göçü temin olgunlaşmamış timositleri kısıtlı. İç medüller timik epitelyum hücreleri (mTECs) indükleyen negatif seçim ya da regülatör T hücre soyu içine sapma ya göre kendinden peptit / MHC kompleksleri için bir yüksek afiniteli TCR olan timositlerin tolerans indüksiyonu katılmaktadırlar. Merkezi tolerans indüksiyonu bağlamında, mTECs Böylece periferik öz yansıtma dokuya sınırlı bir kendi antijenlerine (TRA) çok geniş bir yelpaze ifade etmeleri açısından benzersizdir. Bu olay karışık gen ifadesi olarak adlandırılır (PGE)1,2.

Çeşitli kısa vadeli 2B kültür sistemleri değişmez ilk 2 gün içinde 3-6 MHC sınıf II, FoxN1 ve Aire gibi PGE kaybı ve anahtar düzenleyici moleküllerin sonuçlandı olarak bu büyüleyici hücre tipine En güncel çalışmalar, ex vivo izole hücrelerde güveniyor . Özellikle takımlar ve timus bozulmamış 3D ağda özellikleri 2B modellerinde eksik olan, ancak belirsiz kaldı. Yeniden birikme timik organ kültürü (RTOC) sağlam bir timik mikro-7, şu ana kadar, diğer yandan, sadece 3D, bir yandan, T hücresi gelişiminin çalışma sağlar sistemi ve stromal hücre biyolojisi, olmuştur. Bununla birlikte, RTOCs zaten fetal stromal hücrelerin bilgi girişini içerir ve 5-10 günlük bir maksimum kültür dönemi tahammül bir hücre kompleks bir karışımı içeren, örneğin, bazı sınırlamaları vardır.

in vitro kültür sistemlerinde indirgemeci eksikliği çalışma engellemiştirT hücre gelişimi ve timus organogenez çeşitli yönleri az değil moleküler PGE düzenlenmesi ve mTECs gelişimsel biyoloji ile ilişkisi.

Deri ve timus epitel hücrelerinin yapısal kuruluşun yakın ilişkililik sayesinde, in vitro keratinositlerin farklılaşması taklit ve böylece dermal eşdeğer oluşturmak için başlangıçta geliştirilmiş olan 3D organotipik kültürü (OTC) sistemi için seçti. OTC sistem keratinositler 8,9 numaralı seribaşı olan üzerine fibrin jel, içinde sıkışıp kalırlar dermal fibroblastlar ile kaplanmış inert iskele matriks oluşur. Burada, biz saflaştırılmış mTECs ile keratinositler yerini aldı. Bu modelin temel özellikleri korurken, biz belirli parametreleri optimize edilmiş.

MTECs çoğaldı kabul OTC modelinde, böylece yakından in vivo mTECs geliştirme taklit terminal farklılaşma yapıldı ve mtec kimlik ve PGE muhafaza <sup> 10. Bu teknik not timus OTC aşamalı set-up sağlayan ayrıntılı bir protokol sağlar.

Protocol

Bu çalışma Regierungspräsidium Karlsruhe etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bütün hayvanlar, Almanya Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ), spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi. Yaş 1 ila 7 gün arasında değişen tüm kültür deneyleri fare yavrular için kullanılmıştır. Timustan mTECs 1. izolasyonu Not: aşağıdaki gibi bazı modifikasyonlar ile, steril koşullar altında, daha önce tarif edildiği gibi 1, a…

Representative Results

Biz aslında keratinositlerde 9 in vitro uzun vadeli kültürü için geliştirilmiş olan 3D organotipik ko-kültür modeli (3D OTC) kabul etti. MACS zenginleştirilmiş mTECs (MACS zenginleştirme şeması Şekil 1 e bakınız), bir fibrin jel ve tutulu fibroblastlar içeren bir yapı iskelesi üzerine ekilmiştir. fibroblastlar in vitro mTECs destekleyen temel hücre dışı matriks (ECM) sağlarlar. MTECs hava maruz kalan in vivo ortamı (OTC set-up şeması <st…

Discussion

RTOCs yanı sıra, 3D OTC TEC farklılaşma ve PGE bakım / indüksiyon diğer (i) ile karşılaştırıldığında (Tablo 1) 'basitleştirilmiş 3D kültürlerin' kullanımı açısından çok daha üstün tarafından olmuştur – fibroblastlar yalnız iskele olmaksızın; (Ii) 2 D sistemleri kullanan -, (iii) 3T3-J2 hücreleri TEC klonlar geliştirmek olup, burada, TECS 10 ile birlikte kültürlenmiş fibroblast / besleyici hücreleri ama PGE kaybolur (iv) Matrigel veya (v) ECM bile?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.

Materials

Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Play Video

Cite This Article
Pinto, S., Stark, H., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

View Video