3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
وتتطلب التنمية الخلايا T داخل الغدة الصعترية لشبكه ثلاثي الأبعاد معقدة تتألف من خلايا انسجة مختلفة، أي خلايا غير-T. Thymocytes تجتاز هذه السقالة في النظام الزمني والمكاني منسق للغاية في حين يمر بالتتابع نقاط تفتيش إلزامية، أي T التزام النسب الخلية، تليها T مستقبلات الخلايا الجيل ذخيرة واختيار قبل تصديرها إلى الهامش. الاثنان أنواع الخلايا المقيمين الرئيسية تشكيل هذه السقالة هي الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (cTECs) والنخاعية (mTECs). ومن السمات الرئيسية لmTECs هو ما يسمى التعبير منحل العديد من المستضدات المقيدة الأنسجة. يتم عرض هذه المستضدات المقيدة الأنسجة لغير ناضجة thymocytes بشكل مباشر أو غير مباشر عن طريق mTECs أو الخلايا الجذعية الغدة الصعترية، مما أدى على التوالي في التسامح مع النفس.
مناسبة في المختبر نماذج محاكاة الممرات وظائف التنموية للcTECs وmTECs هي أمريكا اللاتينية والكاريبي حالياالملك. هذا النقص في نماذج تجريبية كافية وعلى سبيل المثال أعاق تحليل التعبير الجيني منحل، التي لا تزال غير مفهومة على المستوى الخلوي والجزيئي. نحن تكييفها لعضوي النمط نموذج التعاون ثقافة 3D لثقافة فيفو السابقين mTECs معزولة. وقد وضع هذا النموذج في الأصل لزراعة القرنية في مثل هذه الطريقة لتوليد ما يعادل الجلد في المختبر. نموذج 3D الحفاظ على ميزات وظيفية رئيسية من MTEC البيولوجيا: (ط) انتشار والتمايز النهائي من CD80 ها اير سلبية في CD80 مرحبا، اير إيجابية mTECs، (ب) الاستجابة لRANKL، و (ج) التعبير متواصلة من FoxN1، اير والجينات المقيدة الأنسجة في CD80 mTECs مرحبا.
Introduction
thymocytes تطوير يشكلون نحو 98٪ من الغدة الصعترية، في حين تتكون المتبقية 2٪ من مجموعة متنوعة من الخلايا التي تؤلف مجتمعة سدى الغدة الصعترية (أي الخلايا الظهارية، والخلايا الجذعية، الضامة، والخلايا B، الخلايا الليفية والخلايا البطانية). الخلايا الظهارية القشرية الخارجية (cTECs) حصاد هجرة الخلايا الموالية-T من نخاع العظم، T نسب الخلية الاستقراء في الخلايا ما قبل-T متعددة القدرات واختيار الإيجابية للMHC الذاتي قيدت thymocytes غير ناضجة. وتشارك الخلايا النخاعية الداخلية الغدة الصعترية الظهارية (mTECs) في الحث التسامح من تلك thymocytes مع تقارب عالية TCR للمجمعات الببتيد الذاتي / MHC إما عن طريق إحداث اختيار سلبية أو انحرافها إلى الخلايا التائية التنظيمية النسب. في سياق الحث التسامح المركزي، mTECs هي فريدة من نوعها من حيث أنها تعبر عن طيف واسع من المستضدات الذاتية المقيدة الأنسجة (ترا) مما يعكس الطرفية النفس. وتسمى هذه الظاهرة منحل التعبير الجيني (فريق الخبراء الدائم)1،2.
معظم الدراسات الحالية على هذا النوع من الخلايا رائعة تعتمد على الخلايا المعزولة خارج الحي، ومختلف النظم ثقافة 2D المدى القصير أدت دائما في خسارة فريق الخبراء الدائم والجزيئات منظم رئيسية مثل الطبقة MHC II، FoxN1 واير في غضون أيام 2 الأولى 3-6 . ومع ذلك فإنه لا يزال غير واضح، والتي مكونات وملامح شبكه 3D سليمة من الغدة الصعترية معينة في عداد المفقودين في نماذج 2D. كانت الثقافة الجهاز الغدة الصعترية إعادة التجميع (RTOC) حتى الآن هو النظام الوحيد الذي يسمح 3D دراسة تطوير الخلايا T، من جهة، وبيولوجيا الخلايا اللحمية، من ناحية أخرى، في المكروية الغدة الصعترية سليمة 7. بعد، RTOCs دينا بعض القيود، أي أنها تحتوي بالفعل خليط معقد من الخلايا، تتطلب مدخلات خلايا انسجة الجنين ويدوم فترة ثقافة القصوى من 5 إلى 10 أيام.
عدم وجود اختزالية في نظم الاستزراع المختبر أعاق دراسةعدة جوانب T تطوير خلية والتوتة توالد ليس أقلها التنظيم الجزيئي للفريق الخبراء الدائم وعلاقته البيولوجيا التطورية من mTECs.
نظرا لقرب القرابة للمنظمة تنظيما للخلايا الظهارية من الجلد والغدة الصعترية، اخترنا ثقافة عضوي النمط (OTC) نظام 3D التي وضعت أصلا لمحاكاة تمايز الخلايا القرنية في المختبر، وبالتالي خلق معادل الجلد. ويتكون النظام OTC من مصفوفة سقالة الخاملة مضافين مع الخلايا الليفية الجلدية التي المحاصرين في هلام الليفين، على الذي هي المصنفة الكيراتينية 8،9. هنا، فإننا استبدال الخلايا الكيراتينية مع mTECs تنقيته. مع الحفاظ على السمات الأساسية لهذا النموذج، ونحن الأمثل معايير معينة.
في نموذج OTC اعتمدت انتشرت mTECs، خضع التمايز النهائي والحفاظ على الهوية MTEC وفريق الخبراء الدائم، ومحاكاة بالتالي عن كثب في الجسم الحي تطوير mTECs <sup> 10. توفر هذه الملاحظة الفنية بروتوكول مفصلة السماح للالتدرجي انشاء لOTCs الصعترية.
Protocol
Representative Results
Discussion
جنبا إلى جنب مع RTOCs، وقد كان OTCs 3D من قبل أعلى بكثير من حيث التمايز TEC وفريق الخبراء الدائم صيانة / الاستقراء (الجدول 1) بالمقارنة مع غيرها (ط) "ثقافات 3D مبسطة" استخدام – الخلايا الليفية وحدها دون السقالة. (ب) نظم 2D باستخدام – الخلايا الليفية / التغذية شارك في تر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
