3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Ontwikkeling thymocyten maken ongeveer 98% van de thymus, terwijl de resterende 2% uit diverse cellen die tezamen vormen het thymus stroma (bijvoorbeeld epitheliale cellen, dendritische cellen, macrofagen, B-cellen, fibroblasten, endotheelcellen). De buitenste corticale epitheelcellen (cTECs) verwerven immigratie van pro-T-cellen van het beenmerg, T cellijn inductie bij multipotente pre-T-cellen en positieve selectie van zelf-MHC beperkte onrijpe thymocyten. De binnenste medullaire thymus epitheelcellen (mTECs) zijn betrokken bij inductie van de thymocyten met hoge affiniteit TCR voor zelf-peptide / MHC-complexen door ofwel induceren negatieve selectie of de afwijking in de regulatoire T-cellijn. In het kader van de centrale tolerantie inductie, mTECs zijn uniek in dat ze drukken een breed spectrum van weefsel beperkt zelf-antigenen (TRA) dus mirroring de perifere zelf. Dit fenomeen wordt promiscue genexpressie genoemd (PGE)^1,2.

De meeste huidige studies over deze fascinerende celtype afhankelijk ex vivo geïsoleerde cellen, diverse korte 2D kweeksystemen steeds resulteerde in het verlies van PGE en belangrijke regulator moleculen zoals MHC klasse II, FoxN1 en Aire binnen de eerste 2 dagen ^3-6 . Het bleef echter onduidelijk welke bepaalde componenten en eigenschappen van het intacte 3D maaswerk van de thymus ontbraken in 2D modellen. De re-aggregatie thymus orgaankweek (RTOC) heeft tot nu toe de enige 3D-systeem dat de studie van T-celontwikkeling mogelijk maakt, enerzijds, en stromale celbiologie, daarentegen is, in een intacte thymus micromilieu ^7. Toch RTOCs bepaalde beperkingen, dat wil zeggen, zij bevatten reeds een complex mengsel van cellen, input nodig foetale bindweefselcellen en doorstaan ​​een maximale kweekperiode van 5-10 dagen.

Het ontbreken van reductionistisch in vitro kweeksystemen heeft de studie van belemmerdverschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling en thymus organogenese niet in het minst de moleculaire regulatie van PGE en haar relatie tot de ontwikkelingsbiologie van mTECs.

Door de nauwe verbondenheid van de gestructureerde organisatie van de epitheelcellen van de huid en de thymus, hebben we gekozen voor een 3D organotypische cultuur (OTC) systeem dat oorspronkelijk was ontwikkeld om de differentiatie van keratinocyten in vitro na te bootsen en zo een dermale equivalent. De OTC bestaat uit een inerte scaffold matrix bedekt met dermale fibroblasten die zijn gevangen in een fibrinegel, waarop keratinocyten geënt ^8,9. Hier hebben we vervangen keratinocyten met gezuiverd mTECs. Terwijl de fundamentele kenmerken van dit model, we geoptimaliseerd bepaalde parameters.

In de vastgestelde OTC model mTECs verspreidden, onderging terminale differentiatie en onderhouden Mtec identiteit en PGE, dus nauw nabootsen in vivo mTECs ontwikkeling <sup> 10. Deze technische notitie geeft een gedetailleerd protocol waardoor de stapsgewijze set-up van de thymus OTC's.