3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
Развитие внутриотраслевой тимуса Т-клеток требует сложной трехмерной сетчатой структуры, состоящей из различных стромальных клеток, то есть, не-Т-клеток. Тимоциты пройти этот эшафот в хорошо скоординированным временной и пространственной того в то время как последовательно проходя обязательные контрольные точки, т.е. Т-клеток коммитирование, а затем поколения репертуара Т-клеточного рецептора и отбора до их экспорта в периферии. Два основных типа клеток, образующих житель этого эшафот являются корковых (cTECs) и мозгового тимуса эпителиальные клетки (mTECs). Ключевой особенностью является mTECs так называемый беспорядочный выражение многочисленных тканевых антигенов ограничено. Эти ткани ограниченным антигены представлены незрелых тимоцитов, прямо или косвенно, mTECs или дендритных клеток тимуса, соответственно в результате аутотолерантности.
Подходящие модели в пробирке эмуляции пути развития и функции cTECs и mTECs настоящее время лаковыекороль. Это отсутствие адекватных экспериментальных моделей, например мешает анализ разнородной экспрессии генов, которая до сих пор мало изучены на клеточном и молекулярном уровне. Мы адаптировали 3D органотипической модель совместного культуры к культуре экс естественных условиях изолированных mTECs. Эта модель была первоначально разработана для выращивания кератиноцитов таким образом, чтобы генерировать эквивалента кожи в пробирке. 3D-модель сохраняется ключевые функциональные особенности Mtec биологии: (I) пролиферации и терминальной дифференцировки CD80 вот, Aire-отрицательной в CD80 привет, Aire-положительных mTECs, (II) отзывчивость к RANKL, и (III) устойчивого выражения FoxN1, Aire и тканей ограниченным гены в CD80 привет mTECs.
Introduction
Разработка тимоцитов составляют около 98% от тимуса, а остальные 2% состоит из множества клеток, которые в совокупности составить в строму тимуса (т.е. эпителиальные клетки, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки). Наружные корковые клетки эпителия (cTECs) обеспечить эмиграцию про-Т-клеток из костного мозга, Т индукции клеточных клонов в мультипотентных предварительно Т-клеток и позитивной селекции самостоятельной MHC ограничено тимоцитов. Внутренние мозговые тимуса эпителиальные клетки (mTECs) участвуют в индукции толерантности этих тимоцитов с высоким сродством ТКР для самостоятельной пептид / МНС комплексов по обе вызывающего негативного отбора или их отклонения в Т нормативно клеток линии. В контексте индукции центральной толерантности, mTECs уникальны тем, что они выражают широкий спектр тканей ограниченным аутоантигены (très), таким образом, зеркальное периферической себя. Это явление называется выражение беспорядочную ген (PGE)1,2.
Большинство современных исследований на эту увлекательную типа клеток зависят от бывших естественных изолированных клеток, а различные краткосрочные 2D культура системы неизменно привели к потере PGE и ключевых молекул регулятора, как MHC класса II, FoxN1 и Aire в течение первых 2 дней 3-6 , Оставалось неясным, однако, какие именно компоненты и особенности неповрежденной 3D сетчатая тимуса в 2D моделей пропали без вести. Повторное объединение тимуса органной культуре (РИПЦ) было до сих пор единственным 3D система, которая позволяет исследовать развитие Т-клеток, с одной стороны, и стромальных клеток биологии, с другой стороны, в здоровом тимуса микросреды 7. Тем не менее, RTOCs имеют определенные ограничения, то есть они уже содержат сложную смесь клеток, требует ввода плода стромальных клеток и выдержать максимальный период культуры 5 до 10 дней.
Отсутствие редукционистская в культурах клеток препятствует изучениенекоторые аспекты развития Т клеток и тимуса органогенеза не менее молекулярная регулирование PGE и его отношения к биологии развития mTECs.
Вследствие тесной связанности-структурированной организации эпителиальных клеток кожи и тимуса, мы выбрали 3D Органотипической культура (OTC) системы, которые были разработаны изначально для эмуляции дифференцировку кератиноцитов в пробирке и, таким образом, создать кожный эквивалент. Внебиржевой системе состоит из инертного лесов матрицы с наложением кожных фибробластов, которые попали в фибрин геля, на который кератиноциты высевают 8,9. Здесь мы заменили кератиноцитов с очищенными mTECs. Сохраняя основные черты этой модели, мы оптимизировали некоторые параметры.
В принятой модели внебиржевом mTECs распространение, прошли терминальную дифференцировку и поддерживается идентичность Mtec и PGE, таким образом, тесно подражая в развитии естественных mTECs <sup> 10. Эта техническая записка содержит подробный протокол, позволяющий пошаговый наладка тимуса ОДКБ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наряду RTOCs, 3D OTCs было намного превосходит по TEC дифференциации и PGE обслуживания / индукции (таблица 1) по сравнению с другими (I) 'упрощенные 3D культуры' с помощью – фибробласты один, без строительных лесов; (II) 2D системах с помощью – фибробласты / фидерные клетки культивируют сов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
