初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

血液脳関門の機能障害は、多発性硬化症におけるBBBの破壊など広範囲に自己反応性免疫細胞によるCNS浸潤を促進し、オリゴデンドロサイトの出会いや破壊を可能にする様々な有害なCNS疾患の顕著な特徴である。虚血性脳卒中では、BBBの破壊および脳浮腫のその後の形成は、二次梗塞の成長と患者⁶の全生存期間に影響を与える重要な要因である。さらに、遠隔地BBBの変化によって焦点虚血性病変は、脳の広範な機能的変化を誘導することができる。しかし、根本的な分子メカニズムは不明な点が多い^5。これとは対照的に、機能的BMECs高密度かつ排出トランスポーターの多様性は、そのような感染症のための脳の悪性腫瘍または抗生物質のための化学療法剤として有益な薬剤の濃度を低減します。そのため、血液脳バーをより深く理解生理学的および病態生理学的条件下でRIER機能は特に好ま方向²¹にバリア機能を調節することができる薬理学的薬剤の開発が求められている。 BBBのin vitroモデルにおける信頼性の高いは、BBBでの調節機構を研究するための不可欠なツールです。

多くの不死化された脳内皮細胞株を確立し、インビトロ BBBモデル²²として用いられてきた。彼らはより速く成長し、いくつかの継代にわたって一定のBBB特性を保つように、これらの細胞株は、プライマリBMECsにわたって特定の利点を提供します。しかし、内皮細胞株は完全にin vivoの状況に実験結果の転写混ざりなどの重要なプロパティが変更された初代細胞を代替することはできません。例えば、マウス脳内皮細胞株bEnd.5高paracにつながる不連続に分布するタイトジャンクショ​​ンタンパク質の低いレベルのみを発現するellular透磁率^23。のbEnd、別の頻繁に使用されるマウス脳内皮細胞株は、緻密で連続的に分布し、タイトジャンクショ​​ン、高内皮性、いくつかの排出トランスポーターと低傍細胞透過性を示している。しかし、のbEnd細胞層の主BMECsに比べ、一定の経と傍細胞基質²⁴の浸透に関して本当の差別を欠いている。

初代細胞培養の調製では、混入細胞が有意に実験結果の妥当性を妨げる可能性があります。記載されたプロトコルでは、pyrumicin高純度を達成するために、内皮細胞のための選択剤として使用される。それにもかかわらず、細胞培養物の定期的な品質管理は、必然的に信頼性のある実験のために保証するために必要とされる。内皮細胞の典型的な形態学的特性（ 図1Aを参照）、transendothelia以外の品質管理のためのいくつかの方法があり、lの抵抗を測定する場合や、そのようなCD31内皮細胞マーカーの発現（ 図1Bを参照）、またはフォンウィルブランド因子（vWF）が評価されるかもしれない。

一匹のマウスの脳から単離された脳内皮細胞の数が比較的低く、複数の実験のための適切な細胞培養を設定することで、いくつかのマウスの脳をプールしなければならない。我々の経験では、少なくとも10匹のマウスは、それぞれの動物施設のリソースに応じて制限する要因かもしれない一つの実験のために使用される必要がある。バイアスや交絡因子を避けるために、同一の遺伝的および環境的背景を持つマウスのみをプールする必要があります。対照的に、ウシおよびブタの脳内皮細胞調製物は、一脳内の利用可能な脳内皮細胞の大多数を提供する。しかし、合併症のない飼育や住宅、利用可能なトランスジェニックマウスの広範かつ増え続けるレパートリーに加えて初代マウスBMECsは理想としてレンダリング血液脳関門の機能を研究するためのモデル。

BBB基礎となる分子機構の機能に関するいくつかの重要な知見は、二次元組織培養系における研究から来ている。最近では、三次元培養系は、内皮細胞が管腔と管状ネットワークを形成できるようにすることコラーゲンマトリックス内に配置されている^{図25に示すように、}開発されてきた。これらの新規な細胞培養系は、 インビボで無傷の生物における血管のプロセスのより正確な再現を可能にする。このような周皮細胞およびアストロサイトなどNVU 3Dで細胞培養系のさらなる細胞の関与は、血液脳関門の機能を研究するin vitroでの革命をもたらすかもしれない。最初のモデルは、最近^26を開発されてきた。

トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項があります。すべての無菌作業の最初は、内皮細胞培養物の品質に必須である。第二に、pyrumycinはセルのみのために追加する必要があります培養の最初の2日間に使用される培地は、長いアプリケーションが増加MBMEC細胞死および低品質のバリア機能につながるかもしれない。第三に、このプロトコルに適用される酵素は、製造業者の指示に従って使用して保存されるべきである。そうでなければそれらの適切な機能が損なわれる可能性があります。内皮細胞が付着しない場合はさらに、細胞培養プレートのコーティングが改正される可能性があります。フィブロネクチンおよびコラーゲンの濃度は、変更される場合があり、または他のマトリックスタンパク質は、コーティング溶液に添加してもよい。最後に、年齢、性別、季節および動物施設内の環境条件がMBMEC分離実験の比較可能性の品質に影響を与える可能性のある重要な要因である。これは、条件が独立した実験の間で同等であることを保証されるべきである。

記載されたプロトコルは、マウスBMECsを分離するための基本的な神経免疫法として考慮されるべきである。単離された細胞は、Uかもしれませんそのような移動アッセイ、遺伝子およびタンパク質発現の研究​​、電気生理学的評価または透過性実験としてBBB機能へのさらなる洞察を得るために、さまざまなアプリケーションのためのsed。上述したように、BMECsの三次元細胞培養系は、NVUの文脈におけるBBBの調節に関与する複雑な機構を研究するための新たな機会を提供するかもしれない。したがって、一次内皮細胞の単離は、将来的にBBB研究の分野で非常に貴重な技術のままである。