JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

Published: November 14, 2014
doi:
10.3791/52204
, , , ,
1Department of Neurology,University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I,University of Münster

Summary

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Abstract

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.

Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.

This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Introduction

Brain microvasculaire endotheelcellen (BMEC) vorm monolagen die een integraal onderdeel van de zeer gespecialiseerde bloed-hersen-barrière (BBB). BMECs zijn verbonden door junction eiwitten aan een basale membraan. Samen met pericyten, gladde spiercellen, astrocytische end voeten en circulerende bloedcellen bouwen zij de zogenaamde neurovasculaire eenheid (NVU) 1. Tegen de vorige notie van een ondoordringbare barrière tussen het bloed en de centrale-zenuwstelsel (CNS), de NVU is een dynamische, zeer specifieke en gereglementeerde interface die de overgang van vloeistoffen, moleculen en cellen tussen cerebrale bloedvaten en de CNS 2 regelt . Een disfunctie of ontregeling van de NVU kan initiëren en / of bijdragen aan verschillende neurovasculaire, infectueuze, ontstekings- of degeneratieve ziekten van het CZS, zoals ischemische beroerte, HIV-encefalopathie, multiple sclerosis, Alzheimer of Parkinson's ziekte 3-6.

_content "> De BMEC monolaag goed afgesloten door een Junctional complex gevormd van vast (TJ) en contactplaatsen (AJ) 7. De hoge elektrische weerstand en de lage paracellulaire permeabiliteit van de BBB zijn voornamelijk gebaseerd op TJ eiwitten 8. De TJs zijn complexen gevormd door de transmembraan eiwitten van de claudin en occludin familie, die gekoppeld zijn aan het cytoskelet van de endotheelcellen door adapter moleculen, zoals zonulaoccludens (ZO) eiwitten ZO1-3 4. contactplaatsen hoofdzakelijk samengesteld door het integrale membraaneiwit vasculaire endotheliale (VE) -cadherin, gekoppeld aan het cytoskelet via cateninen 8.

De afdichting van de BBB voorkomt dat de vrije uitwisseling van substraten en cellen tussen bloed en CSF. Uitzonderingen op deze regel zijn lipofiele, kleine moleculen met een molecuulgewicht <400 Da, die in staat zijn om de BBB oversteken lipidegemedieerde diffusie 9 zijn. De passage van grotere en / ofhydrofiele moleculen, zoals glucose, aminozuren, peptiden, proteïnen en veel medicijnen beperkt tot sterk gecontroleerde transcellulaire transportsystemen 10, die kunnen worden ingedeeld in vijf hoofdcategorieën: carrier-gemedieerd transport, ionentransport, actieve efflux transport, receptor gemedieerde vervoer, en-caveolae gemedieerd transport 4. Deze transporter systemen helpen handhaven van de homeostase van het CZS, die nodig is voor een nauwkeurig signaal genereren, transductie en integratie. Bovendien BMECs kunnen actieve regeling van de overgang afzonderlijke moleculen door de expressie van verschillende ectoenzymes. Deze enzymen zijn gelokaliseerd op het celoppervlak en wijzigen specifieke endogene en exogene substraten hinderen of voor de overgang van de BBB 11.

Overwegende dat de CNS werd beschouwd als een immuun-bevoorrechte orgel voor een lange tijd, recente bevindingen suggereren een vrij dynamisch en strak gereguleerd systeem van immuun surveillance van de CNS. De BMECs spelen een kritieke rol in de regulatie van het immuunsysteem cel transmigratie. Door de expressie van selectinen op hun oppervlak lymfocyten selectief geïnduceerd losjes hechten aan het endotheel. De afscheiding van chemokinen die ontmoeting met specifieke receptoren op leukocyten leidt tot de expressie of conformatieveranderingen van leukocyt integrinen, zoals LFA-1 (lymfocyt functie-geassocieerde antigen 1) en VLA-4 (zeer laat antigeen-4). De integrines bemiddelen een stevige hechting door binding hun endotheliale tegenreceptoren, bijvoorbeeld VCAM-I (vasculaire celadhesiemolecuul), ICAM-I (intercellulaire adhesie molecuul), waardoor de transmigratie in de hersenen parenchym tussen of over BMECs van de BBB 12-14. Deze en andere bevindingen onderstrepen de actieve rol van het endotheel zich in het reguleren van het immuunsysteem cel migratie.

Bovendien BMECs als onderdeel van de NVU zijn betrokken bij de regulatie van de bloedtoevoer naar de hersenen linked lokale neuronale metabole eisen. Bij astrocytaire stimulatie endotheliale cellen vasoactieve stoffen zoals stikstofoxide waardoor relaxatie van vasculaire gladde spiercellen 15.

Angiogenese en neurogenese in de ontwikkeling en in het volwassen hersenshow parallelle patronen en ontwikkeling en hebben veel eigenschappen van voorschrift 1, 4. Endotheelcellen kritieke rol in deze processen 16, 17.

Samenvattend BMECs essentiële elementen om ontwikkeling en werking van het CZS rechtvaardigen. BBB disfunctie is verbonden met vele ernstige neurologische aandoeningen. Echter, slechts een gering aantal targets geïdentificeerd in de hersenen-vaatstelsel interface voor een specifieke en efficiënte behandeling 18. Vereenvoudigde in vitro modellen gebruikt om de betrokken functie en regulering van complexe fysiologische systemen voor lo mechanismen te begrijpenng tijd. De isolatie zoals beschreven door dit manuscript en het in vitro onderzoek van muizen BMECs, gezien de grote verscheidenheid van specifieke knockout muizen-stammen, kan een verder begrip van BBB functie en regulatie verschaffen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden openen van nieuwe therapeutische middelen.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Duitsland") en uitgevoerd volgens de Duitse wet van de dierenbescherming. 1. Algemene opmerkingen voor Mouse Experimenten Voer alle experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de respectievelijke Institutional Animal Care en gebruik Comite. Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat stellen om de toegang tot voedsel en water ad libitum te hebben. Gebruik voor leeftijd en geslacht gematchte muizen in de experimentele groepen, omdat biologische eigenschappen kunnen variëren met leeftijd en geslacht. Waar mogelijk proberen te verminderen, verfijnen of vervangen dierproeven. 2. Voorbereiding van de Percoll Gradient Meng 19 ml 1X PBS met 1 ml 10x PBS, 1 ml FCS en 10 ml Percoll. Voer steRILE filtratie in een glazen buis (diameter filter poriën: 0,2 urn). Daarna de oplossing bij 4 ° C opgeslagen. 3. Bereiding van endotheel celmedium en Coating van celkweekplaten Endotheelcellen medium: Bereiding van 500 ml medium: (. Ongeveer 20%) Meng 400 ml DMEM medium (. Ongeveer 80%) met 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml; circa 0,05%), 0,5 ml heparine (100 pl / ml,. ongeveer 0,1%) en 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml,. ongeveer 0,1%). Voeg pyrumycin alleen celkweekmedium in de eerste 2 dagen kweken. Voer steriele filtratie in een glazen buis (diameter filter poriën: 0,2 urn). Daarna de oplossing bij 4 ° C opgeslagen. Coating van celkweek platen: 1 ml van coating opgelost, een oplossing van 500 pl DDH 2 O, 400 ul collageen IV (0,4 mg / ml) en 100 gl fibronectine (0,1 mg / ml). Bedek het hele oppervlak van each goed van de celkweek plaat met de coating oplossing. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht. 4. Isolatie van Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen (MBMEC) Offer 10 volwassen muizen (8-12 weken oud, C57BL / 6) door cervicale dislocatie. Daarna isoleren de muis-hersenen en opslaan in 5 ml PBS (Waarschuwing: Werk steriel). Verwijderen hersenen stengels, cerebella en Thalami met een pincet. Los hersenvliezen door voorzichtig het rollen van de hersenen op een steriele vloeipapier. Verzamel de overgebleven hersenvliezen-vrije voorhersenen. Breng de hersenen om een ​​50 ml Falcon buis gevuld met 13,5 ml van DMEM. Hak het weefsel eerst met een pipet 25 ml, vervolgens met een pipet 10 ml, totdat de media wordt melkachtig. Verteren dan het weefsel met een mengsel van 0,6 ml collagenase CLS2 (10 mg / ml in DMEM) en 0,2 ml DNAse (1 mg / ml in PBS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gedurende 1 uur bij 37 ° C op een orbitale schuddenr 180 rpm. Voeg 10 ml DMEM toegevoegd aan de weefselsuspensie en centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Weggooien supernatant (Waarschuwing:! Pellet wordt makkelijk kwijt te raken) De myeline verwijderen, resuspendeer de pellet met een pipet 25 ml in 25 ml van BSA-DMEM (20% w / v) (ong. 25 keer) en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi de bovenste myelinelaag (melkachtig) met een gebroken glazen Pasteur pipet met grotere diameter, en vervolgens de BSA laag met een normale Pasteur pipet ontdoen. Resuspendeer de pellet in 9 ml DMEM en voeg 1 ml collagenase / dispase (eindconcentratie 1 mg / ml) en 0,1 ml DNAse. Digest de oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C op een orbitale schudder bij 180 rpm (waarschuwing: geen pipet om resuspenderen – cellen verloren). Tijdens de vertering wordt gecentrifugeerd Percoll oplossing om de dichtheidsgradiënt met een ultracentrifuge bij 3000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C, met versnelling, without rem. Voeg 10 ml van DMEM aan de geknipte celsuspensie. Centrifugeer de suspensie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi dan het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml DMEM. Voeg de geresuspendeerde cellen voorzichtig op de Percoll gradiënt en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C zonder versnelling en rem. Opmerking: De cellen zijn zichtbaar als een wolk in de interfase. Neem ca. 12 ml van de interfase met cellen met een lange steriele naald en plaats deze in een nieuwe 50 ml Falcon met 5 ml van DMEM. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Daarna resuspendeer de pellet in endotheelcellen medium (gebruik ong. 0,2 ml medium per 1 cm2 oppervlak van celkweekplaat). Verwijder coating oplossing uit gecoate celcultuur platen (zie stap 3.2) en spoel elke goed met steriele PBS in twee opeenvolgende stappen wassen. Handhaaf celculturen in endothelialecelmedium bij 37 ° C en 5% CO2 in een steriele incubator. Verander het medium elke twee tot drie dagen. Split cellen 90% samenvloeiing.

Representative Results

Onmiddellijk na isolatie van muis BMECs en contaminerende cellen vormen conglomeraten drijvend in het celkweekmedium (Figuur 1A, dag 0). De behandeling met pyrumycin leidt tot een selectie van murine BMECs aangezien hoge niveaus van effluxtransporters zoals P-glycoproteïne leidt tot een relatieve resistentie tegen toxines. Contaminerende cellen veel gevoeliger voor cytotoxiciteit 19 pyrumycin. Tijdens het pyrumicin selectie contaminerende cellen binnen apoptotische of necrotische celdood, terwijl MBMECs gaan hechten aan het collageen IV / fibronectine gecoate celcultuur platen (Figuur 1A, dag 1 en dag 2). Tot dag 5, de MBMECs prolifereren tot een dichtheid van circa. 80-90%. Kenmerkend is de typische spoelvormige uiterlijk. Bij samenvloeiing, vormen ze een monolaag van samengeperst longitudinaal uitgelijnd en niet-overlappende contact geremde cellen (Figuur 1A, dag 5). Doorpyrumicin keuze, een hoge zuiverheid tot 99% MBMEC bereikt zoals blijkt uit de endotheelcellen marker CD31 (PECAM1 Figuur 1B). De MBMECs vormen strak verzegelde monolagen verbonden door tight junction eiwitten. Na 7-8 dagen kweken, de endotheelcel lagen opgebouwd stabiele waarden voor elektrische weerstand (tot specifieke waarden tussen 20 – 30 Ω cm x 2). En capaciteit (figuur 1C) Op dit tijdpunt functionele assays zoals cel- migratie experimenten 3, 20,21 en permeabiliteit testen, bijvoorbeeld met Evans blauw of dextran, moet worden uitgevoerd. Figuur 1. Morfologische en functionele eigenschappen van Muriene BMECs. (A) Vertegenwoordiger tijdsverloop van gekweekte BMECs bekeken door transmissie licht microscopie over 5 dagen. Schaalbalk geldt voor alle beelden. (B) Immunofluorescentiekleuring de endotheliale merker CD31 op dag 5. CD31 (groen) en DAPI (blauw). (C) cellen werden voorgekweekt gedurende 5 dagen en vervolgens overgebracht naar een geautomatiseerd systeem voor analyse van de biofysische eigenschappen (weerstand en capaciteit). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Bloed-hersen-barrière disfunctie is een kenmerk van diverse schadelijke CNS ziekten, bijvoorbeeld een uitsplitsing van de BBB bij multiple sclerose faciliteert uitvoerig de CNS invasie door autoreactieve immuuncellen en maakt de ontmoeting en de vernietiging van oligodendrocyten. In ischemische beroerte de verstoring van de BBB en de daaropvolgende vorming van hersenoedeem zijn kritische factoren die secundaire infarct groei en de algehele overleving van de patiënten 6 beïnvloeden. Bovendien, door veranderingen van de BBB in afgelegen gebieden focale ischemische letsels zijn in staat om op grote schaal functionele veranderingen in de hersenen veroorzaken. De onderliggende moleculaire mechanismen grotendeels onbekend 5. In tegenstelling, de hoge dichtheid en diversiteit van transporters in functionele BMECs vermindert de concentratie van heilzame geneesmiddelen zoals chemotherapeutische middelen voor de hersenen maligniteiten of antibiotica infectieziekten. Daarom is een dieper begrip van de bloed-hersen-barrier functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden moet farmacologische middelen die in staat zijn specifiek de barrièrefunctie van de favoriete richting 21 te ontwikkelen. Betrouwbaar in vitro modellen van de BBB zijn onmisbare hulpmiddelen voor de regulerende mechanismen op BBB bestuderen.

Vele geïmmortaliseerde hersenen endotheliale cellijnen werden bepaald en gebruikt als in vitro modellen BBB 22. Deze cellijnen bieden bepaalde voordelen ten opzichte van de primaire BMECs omdat ze sneller groeien en houden bepaalde BBB kenmerken over verschillende passages. Echter, endotheliale cellijnen niet volledig vervangen primaire cellen als belangrijkste eigenschappen zijn veranderd vermengen met de overdraagbaarheid van experimentele bevindingen aan de in vivo situatie. Bijvoorbeeld, het murine hersenen endotheelcellijn bEnd.5 expressie slechts lage niveaus van discontinu verdeelde tight junction eiwitten leidt tot hoge Paracellular permeabiliteit 23. BEnd.3, een andere vaak gebruikte muizen hersenen endotheelcellijn, demonstreert dicht en continu verdeeld krappe kruispunten, een hoge transendothele weerstand, diverse transporters en lage paracellulaire permeabiliteit. Echter, bEnd.3 cellagen opzichte primaire BMECs missen een echte discriminatie bij de permeatie van bepaalde transcellulaire en paracellulaire substraten 24.

In de voorbereidingen van primaire celculturen kunnen besmetten cellen significant interfereren met de validiteit van experimentele bevindingen. In het beschreven protocol, wordt pyrumicin als selectiemiddel voor endotheelcellen hoge zuiverheid te bereiken. Niettemin wordt een regelmatige kwaliteitscontrole van de celkweek onvermijdelijk ter garantie voor een betrouwbare experimenten. Er zijn verschillende methoden voor de kwaliteitscontrole, naast typische morfologische eigenschappen van endotheelcellen (zie figuur 1A), de transendothelial weerstand kan worden gemeten of de expressie van endotheelcel merker zoals CD31 (zie figuur 1B) of von Willebrand factor (vWF) kan worden geëvalueerd.

Het aantal brein endotheelcellen geïsoleerd van muizenhersenen relatief laag en om een ​​goede celkweek voor meerdere experimenten, de hersenen van verschillende muizen worden samengevoegd. In onze ervaring hebben minstens 10 muizen worden gebruikt voor een experiment dat een beperkende factor kan zijn afhankelijk van de middelen van het betreffende dier faciliteit. Om vertekening en verstorende factoren te vermijden, mag alleen muizen met een identieke genetische achtergrond en omgevingsfactoren worden gebundeld. Daarentegen runderen en varkens hersenen endotheelcellen preparaten bieden een groot aantal brein endotheelcellen in één hersenen. Echter, naast de ongecompliceerde fokken en huisvesting, het brede en steeds groeiende repertoire van beschikbare transgene muizen renders primaire muizen BMECs als een ideaalmodel om bloed-hersen-barrière functie te bestuderen.

Enkele belangrijke bevindingen met betrekking tot de functies van de BBB en de onderliggende moleculaire mechanismen zijn afkomstig uit studies in 2D weefselkweeksystemen. Onlangs hebben 3D kweeksystemen ontwikkeld 25, waarbij endotheelcellen in een collageen matrix waardoor zij lumen en buisvormige netwerken vormen geplaatst. Deze nieuwe celkweek systemen zorgen voor een nog nauwkeurigere weergave van vasculaire processen in het intacte organisme in vivo. De betrokkenheid van verdere cellen van de NVU in 3D celkweek systemen, zoals pericyten en astrocyten zou een revolutie op de in vitro bestuderen van de bloed-hersen-barrière-functie; eerste modellen zijn recentelijk ontwikkeld 26.

Er zijn een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen. Allereerst steriel werken is essentieel voor de kwaliteit van de endotheliale celkweek. Ten tweede moet pyrumycin alleen worden toegevoegd voor mobielegebruikte kweekmedium in de eerste 2 dagen van de cultuur, misschien langer toepassing leiden tot een verhoogde MBMEC celdood en lage kwaliteit barrièrefunctie. Ten derde moet het toegepast in dit protocol enzymen worden gebruikt en opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant; anders hun functie zouden kunnen worden aangetast. Bovendien zou de coating van celkweek platen worden gewijzigd indien endotheelcellen niet hechten. Concentraties van fibronectine en collageen kan worden veranderd of andere matrixeiwitten kunnen worden toegevoegd aan de bekledingsoplossing. Ten slotte, leeftijd, geslacht, tijd van het jaar en de omgevingsomstandigheden binnen het dier faciliteit zijn belangrijke factoren die de kwaliteit van MBMEC isolatie en vergelijkbaarheid van experimenten zouden kunnen beïnvloeden. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen onafhankelijke experimenten.

De beschreven protocol moet worden beschouwd als een basis neuroimmunologische methode murine BMECs isoleren. De geïsoleerde cellen kunnen zijn used voor een breed scala van toepassingen in om meer informatie BBB functie, zoals migratie assays, gen- en eiwitexpressie studies, elektrofysiologische evaluaties of permeabiliteit experimenten krijgen. Zoals hierboven aangegeven kan 3D celculturen van BMECs nieuwe mogelijkheden om de complexe mechanismen betrokken bij de regulatie van de BBB in de context van de NVU onderzoek te verrichten. Daarom zal de isolatie van primaire endotheelcellen een waardevolle techniek op het gebied van BBB onderzoek in de toekomst blijven.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 – CIM), Universiteit van Münster (aan SB en SGM) en door de Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 aan SB en SGM). Wij danken Heike Blum voor de uitstekende illustraties.

Materials

bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A9418 Bovine serum albumine
Collagenase CLS2 Worthington LS004176 High relative level of protease activity
Collagenase-dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV Sigma Aldrich C0543 From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM Sigma Aldrich D5030 Warm in 37 °C water bath before use
DNAse Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin Sigma Aldrich H3393 Anticoagulant
PDS First Link UK Ltd. 60-00-850 Plasma-derived serum
Percoll Sigma Aldrich P1644 Warm to room temperature before use
Pyrumycin Sigma Aldrich P8833 Should only be used in first 2 d of culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neuwelt, E. A., et al. Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology. Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).
  2. Ohtsuki, S., Terasaki, T. Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development. Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).
  3. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).
  4. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron. 57, 178-201 (2008).
  5. Stoll, G., et al. Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).
  6. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome. Stroke. 42, 1081-1089 (2011).
  7. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).
  8. Bazzoni, G., Dejana, E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis. Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).
  9. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).
  10. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).
  11. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  13. Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).
  14. Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).
  15. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).
  16. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, 562-566 (2010).
  17. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).
  18. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  19. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  20. Ruck, T., et al. CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation. PLoS One. 8, 81455 (2013).
  21. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  22. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).
  23. Watanabe, T., et al. Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).
  24. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, 95-112 (2003).
  25. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115, 5259-5269 (2010).
  26. Urich, E., et al. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Scientific reports. 3, (2013).

Tags

Primary Murine Brain Microvascular Endothelial CellsBlood-brain-barrierNeurovascular UnitIn Vitro ModelIsolationPurificationCulture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (93), e52204, doi:10.3791/52204 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image