בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל
Summary
Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.
Abstract
The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.
Introduction
monolayers צורת כלי דם במוח בתאי האנדותל (BMEC) שמהווה חלק בלתי נפרד של מחסום הדם-המוח-מחסום מאוד מיוחד (BBB). BMECs הם מחוברים על ידי חלבוני junctional המצורפים קרום במרתף. יחד עם pericytes, תאי שריר חלק, רגלי סוף astrocytic ותאי דם במחזור הם לבנות את היחידה שנקרא עצבים וכלי הדם (NVU) 1. נגד הרעיון הקודם של מחסום בלתי חדיר בין העצבים-המערכת-המרכזית (CNS) בדם ו, NVU הוא ממשק דינמי, מאוד ספציפי ופיקוח השולט על המעבר של נוזלים, מולקולות ותאים בין כלי דם במוח ומערכת העצבים המרכזיים 2 . תפקוד לקוי או חוסר ויסות של NVU עשוי ליזום ו / או לתרום למגוון רחב של עצבים וכלי דם, מחלות זיהומיות, דלקתיות או ניוונית של מערכת העצבים המרכזית, כגון שבץ איסכמי, HIV-אנצפלופתיה, טרשת נפוצה, מחלת פרקינסון 3-6 באלצהיימר או ב.
_content "> monolayer BMEC הוא סגור היטב על ידי מורכב junctional היווה של הדוק (TJ) וadherens צמתים 7. ההתנגדות החשמלית הגבוהה וחדירות paracellular הנמוכה של BBB (AJ) מבוססים בעיקר על חלבוני TJ 8. TJS הם מתחמים שהוקמו על ידי החלבונים הטרנסממברני של משפחת claudin וoccludin, שהנם צמודים לשלד התא של תאי האנדותל על ידי מולקולות מתאם, כגון zonulaoccludens (ההסתדרות הציונית) חלבוני ZO1-3 4. צמתים Adherens בעיקר שנאספו על ידי חלבון הקרום נפרד -cadherin כלי דם האנדותל (VE), אשר קשור לשלד התא באמצעות catenins 8.האיטום ההדוק של BBB מונע מעבר חופשי של מצעים ותאים בין הדם לCSF. יוצאים מכלל זה הם מולקולות lipophilic, קטנות עם משקל מולקולרי <400 Da, אשר מסוגל לחצות את BBB על ידי דיפוזיה בתיווך שומנים 9. המעבר של גדולים ו / אומולקולות הידרופילי, כגון גלוקוז, חומצות אמינו, פפטידים, חלבונים ותרופות רבות מוגבלת למערכות מבוקרות מאוד transcellular תחבורת 10, אשר יכול להיות מסווגת לחמש קטגוריות עיקריות: תחבורה בתיווך מוביל, הובלת יון, תחבורת זרימה פעילה, קולטן בתיווך תחבורה, ותיווך caveolae תחבורה 4. מערכות טרנספורטר אלה מסייעים לשמור על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית, אשר נדרש עבור דור אות מדויק, התמרה ואינטגרציה. יתר על כן, BMECs מסוגל לשלוט באופן פעיל את המעבר של מולקולות שונות על ידי הביטוי של מגוון רחב של ectoenzymes. אנזימים אלה הם נקודות על פני התא ולשנות מצעים במשק ומחוצים ספציפיים פוגעים או מאפשרים את המעבר של 11 BBB.
ואילו מערכת העצבים המרכזית נחשבת כאיבר חיסוני הרשאות לזמן ארוך, ממצאים חדשים מורים על מערכת ולא דינמית וחזק מוסדרת של surv חיסוניeillance של מערכת העצבים המרכזית. BMECs מעורב באופן ביקורתי ברגולציה של גלגול תא חיסוני. על ידי הביטוי של selectins על הלימפוציטים משטחם באופן סלקטיבי מושרה לצרף לאנדותל באופן רופף. הפרשת כמוקינים שנתקלים עם קולטן ספציפי על כדוריות דם לבנות מובילה לביטוי או שינויי קונפורמציה של integrins ויקוציטים, כגון LFA-1 (פונקצית הלימפוציטים קשור אנטיגן-1) וVLA-4 (אנטיגן-4 מאוד מאוחר). Integrins לתווך הידבקות חברה באמצעות קשירת counterreceptors אנדותל, למשל VCAM-I (מולקולת הידבקות תא וכלי דם),-אני ICAM (מולקולת הידבקות אינטר) המאפשר הגלגול לתוך parenchyma המוח בין אם באמצעות BMECs של 12-14 BBB. אלה וממצאים אחרים מדגישים את התפקיד הפעיל של האנדותל עצמו בהסדרת נדידת תאים חיסונית.
יתר על כן, BMECs כחלק מNVU מעורב בוויסות של זרימת דם המוחי linked לדרישות המטבוליות עצביות מקומיות. על גירוי astrocytic תאי האנדותל לייצר חומרי vasoactive כגון תחמוצת חנקן שמובילה להרפיה של תאי שריר חלק בכלי דם 15.
אנגיוגנזה ונוירוגנזה בפיתוח, כמו גם בדפוסים מקבילים תכנית המוח הבוגרת ופיתוח ולשתף את נכסים רבים של רגולציה 1, 4. תאי האנדותל מעורבים באופן ביקורתי בתהליכים אלה 16, 17.
לסיכום, BMECs מספק תכונות חיוניות כדי להצדיק פיתוח ותפקודה תקין של מערכת העצבים המרכזית. תפקוד לקוי של BBB קשור להפרעות רבות נוירולוגים חמורות. עם זאת, רק מעט מאוד מטרות זוהו בממשק המוח-כלי דם לטיפול ספציפי ויעיל 18. פשוט במודלים חוץ גופית היה בשימוש כדי להבין את המנגנונים מעורבים בתפקוד ורגולציה של מערכות פיזיולוגיות מורכבות עבור loזמן ng. הבידוד כפי שתואר על ידי כתב היד הזה והמחקר במבחנה של BMECs העכברי, בהתחשב במגוון הרחב של נוקאאוט-זני עכבר ספציפי, עשוי לספק הבנה נוספת של פונקצית BBB ורגולציה בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological פתיחת אפיקים טיפוליים חדשים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תפקוד לקוי של דם למוח-מכשול הוא סימן היכר של מחלות של מערכת העצבים המרכזית מזיקות שונות, למשל פירוט של BBB בטרשת נפוצה באופן נרחב מאפשר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תאי מערכת חיסון אוטוריאקטיבים ומאפשר מפגש והרס של oligodendrocytes. בשבץ איסכמי שיבוש BBB והיווצרות הבאה של בצקת במוח הם גורמים קריטיים המשפיעים על צמיחת אוטם משנית וההישרדות הכוללת של חולים 6. יתר על כן, על ידי שינויים של BBB באזורים מרוחקים נגעים איסכמיים מוקד יכולים לגרום לשינויים פונקציונליים נרחבים של המוח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס הם במידה רבה לא ידועים 5. בניגוד לכך, הצפיפות הגבוהה והמגוון של מובילים בזרימת בBMECs הפונקציונלי מפחיתים את הריכוז של תרופות מועילות כגון chemotherapeutics לממאירויות מוח או אנטיביוטיקה לטיפול במחלות זיהומיות. לכן, הבנה עמוקה יותר של הדם-המוח-ברRier לתפקד בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological נדרש לפתח סוכנים תרופתיים שמסוגלים לווסת באופן ספציפי את תפקוד המחסום בכיוון המועדף 21. אמין במודלים חוץ גופית של BBB הם כלים הכרחיים כדי לחקור את מנגנוני הרגולציה בBBB.
שורות תאי אנדותל המוח הונצחו רבות הוקמו והועסקו כבמודלים חוץ גופית BBB 22. שורות תאים אלה מציעים יתרונות מסוימים על פני BMECs העיקרי כפי שהם גדלים מהר יותר ולשמור על מאפייני BBB מסוימים על פני מספר קטעים. עם זאת, שורות תאי אנדותל לא יכולות להחליף באופן מלא לתאים ראשוניים תכונות חשובות כמו משתנות שמתערבבים עם אפשרות ההעברה של ממצאים ניסיוניים למצב in vivo. לדוגמא, שורת תאי אנדותל מוח העכברית bEnd.5 מבטא רמות נמוכות רק של חלבוני צומת הדוקים מופצים discontinuously המוביל לגבוה paracחדירות ellular 23. BEnd.3, עוד שורת תאים המשמשת לעתים קרובות עכברית אנדותל המוח, מדגימה צמתים צפופים ורציפים מופצים הדוקים, התנגדות Transendothelial גבוהה, כמה מובילים בזרימת וחדירות paracellular נמוכות. עם זאת, שכבות תאי bEND.3 לעומת BMECs העיקרי חסרות אפליה של ממש ביחס לחלחול של transcellular מסוים ומצעי paracellular 24.
בהכנות של תרביות תאים ראשוניות, תאי זיהום יכולים להפריע באופן משמעותי עם התוקף של ממצאים ניסיוניים. בפרוטוקול המתואר, pyrumicin משמש כסוכן סלקטיבית לתאי אנדותל כדי להשיג טוהר גבוה. עם זאת, בקרת איכות רגילה של תרבית התאים נחוצה באופן בלתי נמנע להבטחת לניסויים אמינות. ישנן מספר שיטות לבקרת איכות, חוץ ממאפיינים טיפוסיים מורפולוגי של תאי האנדותל (ראה איור 1 א '), transendotheliaהתנגדות l עשויה להימדד או הביטוי של סמן תא אנדותל כגון CD31 (ראה איור 1) או גורם פון Willebrand (vWF) עשוי להיות מוערך.
מספר תאי אנדותל מוח המבודדים ממוח עכבר אחד הוא יחסית נמוך ולהגדיר את תרבות תאים תקינה לניסויים רבים, מוחם של כמה עכברים צריך להיות ויקווה. מניסיוננו, לפחות 10 עכברים צריכים לשמש לניסוי אחד שעשויה להיות גורם מגביל בהתאם למשאבים של מתקן בעלי החיים בהתאמה. כדי למנוע הטיה או גורמים מבלבלים, עכברים רק עם רקע גנטי וסביבתי זהה יש ייקוו. בניגוד לכך, שור והכנות תא אנדותל המוח חזיריות מספקים מספר רב של תאי האנדותל פנוי במוח במוח אחד. עם זאת, מלבד הרבייה לא מסובכת ודיור, רפרטואר הרחב והולך וגובר של עכברים הטרנסגניים זמינים הופך עכברי העיקרי BMECs כאידאלמודל ללמוד לתפקד דם-המוח-גדר.
כמה ממצאים מרכזיים הנוגעים לתפקידי BBB והמנגנונים המולקולריים שבבסיס הגיעו ממחקרים במערכות תרבית רקמת 2D. לאחרונה, מערכות תרבות 3D פותחו 25, שבו תאי אנדותל ממוקמים בתוך מטריצת הקולגן המאפשרת להם ליצור לום ורשתות צינורי. מערכות תרבית תאים החדשות אלה מאפשרים לעוד יותר מדויקים רבייה של תהליכים וכלי דם באורגניזם שלם in vivo. מעורבותם של תאים נוספים של מערכות תרבית תאי NVU ב3D, כגון pericytes והאסטרוציטים עשויה לחולל מהפכה לומדת בתפקוד דם-מוח-מחסום במבחנה; לאחרונה דגמים הראשונים פותחו 26.
יש כמה המלצות לפתרון בעיות. קודם כל העבודה סטרילית הוא חיוני לאיכות של תרבית תאי אנדותל. שנית, pyrumycin יש להוסיף רק לתאהתרבות בינונית המשמש ב2 הימים הראשונים של תרבות, יישום עוד עלול להוביל למוות מוגבר MBMEC תא ותפקוד מחסום באיכות נמוכה. שלישית, יש להשתמש באנזימים המיושמים בפרוטוקול זה ומאוחסנים בהתאם להוראות היצרן; אחרת התפקוד התקין שלהם עלול להיות בסכנה. יתר על כן, הציפוי של צלחות תרבית תאים עשוי להיות מתוקן אם תאי האנדותל אינם מייחסים. ריכוזים של פיברונקטין וקולגן עשויים להיות שונה או חלבוני מטריצה אחרים עשויים להתווסף לפתרון הציפוי. לבסוף, גיל, מין, עונה של השנה והתנאים סביבתיים במתקן בעלי החיים הם גורמים חשובים שעשויות להשפיע על איכות בידוד MBMEC וההשוואתיות של ניסויים. יש להבטיח כי תנאים דומים בין ניסויים בלתי תלויים.
הפרוטוקול המתואר צריך להיחשב כשיטת neuroimmunological בסיסית לבודד BMECs העכברי. התאים המבודדים יכולים להיות uSED למגוון רחב של יישומים, כדי להעמיק לתוך פונקצית BBB, כגון מבחני הגירה, גן ומחקרי ביטוי חלבון, הערכות אלקטרו או ניסויי חדירות. כאמור לעיל, מערכות תרבית תאי 3D של BMECs עשויות לספק הזדמנויות חדשות לחקור את המנגנונים המורכבים מעורבים בוויסות של BBB בהקשר של NVU. לכן, הבידוד של תאי האנדותל עיקריים יישאר טכניקה לא יסולא בפז בתחום מחקר BBB בעתיד.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר (IZKF) מינסטר הקליני (SEED 12/03, SB), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), תאים-בתנועה האשכול של אקסלנס (1003 EXC – CIM), אוניברסיטת מינסטר (לSB וSGM) ועל ידי קרונה-Fresenius-Stiftung השאר (2012_A88 לSB וSGM). אנו מודים ליקה בלום לאיורים מעולים.
Materials
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumine |
| Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
| Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
| DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
| PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
| Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 d of culture |
References
- Neuwelt, E. A., et al. Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology. Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).
- Ohtsuki, S., Terasaki, T. Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development. Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).
- Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Stoll, G., et al. Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).
- Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome. Stroke. 42, 1081-1089 (2011).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).
- Bazzoni, G., Dejana, E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis. Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).
- Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).
- Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).
- Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).
- Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, 562-566 (2010).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
- Ruck, T., et al. CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation. PLoS One. 8, 81455 (2013).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).
- Watanabe, T., et al. Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).
- Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, 95-112 (2003).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115, 5259-5269 (2010).
- Urich, E., et al. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Scientific reports. 3, (2013).
