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Neuroscience

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Published: November 14, 2014
doi:
10.3791/52204
, , , ,
1Department of Neurology,University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I,University of Münster

Summary

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Abstract

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.

Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.

This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Introduction

microvasculaires du cerveau des cellules endothéliales (BMEC) monocouches de forme qui sont une partie intégrante de la barrière sang-cerveau-barrière hautement spécialisée (BBB). BMECs sont reliées entre elles par des protéines de jonction fixées à une membrane basale. Ensemble avec les péricytes, les cellules musculaires lisses, les pieds astrocytaires d'extrémité et des globules circulant elles accumulent l'unité neurovasculaire dite (NVU) 1. Contre la notion précédente d'une barrière imperméable entre le sang et le-du système nerveux central (SNC), la NVU est une interface dynamique, hautement spécifique et réglementé qui contrôle le passage des fluides, des molécules et des cellules entre les vaisseaux sanguins cérébraux et du système nerveux central 2 . Un dysfonctionnement ou dérèglement de la NVU peuvent initier et / ou contribuer à une variété de neurovasculaires, les maladies infectieuses, inflammatoires ou dégénératives du système nerveux central, tels que l'AVC ischémique, le VIH-encéphalopathie, la sclérose en plaques, maladie de Parkinson 3-6 Alzheimer ou.

_content "> La monocouche BMEC est hermétiquement fermé par un complexe de jonction constitué de serré (TJ) et jonctions adhérentes (AJ) 7. La résistance électrique élevée et la faible perméabilité paracellulaire de la BHE sont principalement basées sur les protéines TJ 8. Les JT sont les complexes formés par les protéines transmembranaires de la famille de la claudine et occludine, qui sont liés au cytosquelette des cellules endotheliales par des molécules d'adaptateurs, tels que les zonulaoccludens (ZO) des protéines ZO1-3 4. jonctions adhérentes sont essentiellement assemblés par la protéine membranaire intégrale l'endothélium vasculaire (VE) -cadherin, qui est lié au cytosquelette via caténines 8.

La fermeture hermétique de la BHE empêche le libre échange des substrats et des cellules entre le sang et le LCR. Les exceptions à cette règle sont lipophiles, les petites molécules ayant un poids moléculaire <400 Da, qui sont capables de traverser la BHE par médiée par des lipides diffusion 9. Le passage d'une plus grande et / oumolécules hydrophiles, tels que le glucose, les acides aminés, les peptides, les protéines et de nombreux médicaments est limitée à des systèmes hautement contrôlées transcellulaires de transport 10, qui peuvent être classés en cinq grandes catégories: le transport de porte-médiation, le transport d'ions, le transport d'efflux actif, médiée par le récepteur transports, et caveolae-transport médié par 4. Ces systèmes de transporteur permet le maintien de l'homéostasie du système nerveux central, qui est nécessaire pour la production d'un signal précis, la transduction et l'intégration. En outre, BMECs sont capables de contrôler activement le passage de molécules distinctes par l'expression d'une variété de ectoenzymes. Ces enzymes sont localisées sur la surface cellulaire et de modifier des substrats endogènes et exogènes spécifiques empêchant ou en permettant le passage de la barrière hématoencéphalique 11.

Alors que le CNS a été considéré comme un organe immunitaire privilégié pour un long temps, des découvertes récentes suggèrent un système plutôt dynamique et bien réglementé de surv immunitairequ'une procédure du système nerveux central. Les BMECs sont gravement impliqués dans la régulation de la transmigration des cellules immunitaires. Par l'expression des sélectines sur les lymphocytes de surface sont induites sélectivement pour fixer de manière lâche à l'endothélium. La sécrétion de chimiokines qui se heurtent à des récepteurs spécifiques sur les leucocytes conduit à l'expression ou de changements de conformation des intégrines leucocytaires telles que LFA-1 (fonction lymphocytaire antigène-1 associé) et VLA-4 (antigène très tardif 4). Les intégrines la médiation d'une adhésion ferme par leurs counterreceptors endothéliales, par exemple, VCAM-I (vasculaire molécule d'adhésion cellulaire), ICAM-I (molécule d'adhésion intercellulaire) permettant la transmigration dans le parenchyme cérébral entre ou à travers BMECs du 12-14 BBB contraignant. Ces résultats et d'autres soulignent le rôle actif de l'endothélium dans la régulation de la migration elle-même des cellules immunitaires.

En outre, BMECs dans le cadre de la NVU est impliquée dans la régulation de la li débit sanguin cérébralnked aux demandes métaboliques neuronaux locaux. Lors de la stimulation des cellules endotheliales astrocytaire produisent des substances vasoactives telles que l'oxyde nitrique conduit à la relaxation des cellules musculaires lisses vasculaires 15.

L'angiogenèse et la neurogenèse dans le développement ainsi que dans le cerveau adulte présente des motifs et le développement parallèle et partagent beaucoup de propriétés de régulation 1, 4. Les cellules endothéliales sont gravement impliqués dans ces processus 16, 17.

En résumé, BMECs fournir les caractéristiques essentielles pour justifier un bon développement et fonctionnement du SNC. BBB dysfonctionnement est lié à de nombreux troubles neurologiques graves. Cependant, très peu de cibles ont été identifiées à l'interface cerveau-vasculaire pour un traitement spécifique et efficace 18. Simplifiée des modèles in vitro ont été utilisées pour comprendre les mécanismes impliqués dans la fonction et la régulation des systèmes physiologiques complexes pour un lotemps ng. L'isolement comme décrit par ce manuscrit et l'étude in vitro de souris BMECs, étant donné la grande variété de souris knock-out spécifique-souches, pourrait permettre une meilleure compréhension de la fonction BBB et de la réglementation dans des conditions physiologiques et physiopathologiques ouverture de nouvelles voies thérapeutiques.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par les autorités locales ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; Recklinghausen, Allemagne") et menées conformément à la loi allemande de protection des animaux. 1. Observations générales pour l'expérimentation de la souris Effectuer toutes les expériences utilisant des souris en conformité avec les directives du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux respectif. Gardez les souris dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et leur permettre d'avoir accès à la nourriture et de l'eau ad libitum. Utilisez la souris âge et le sexe dans les groupes expérimentaux parce que les propriétés biologiques peuvent varier avec l'âge et le sexe. Chaque fois que possible, essayez de réduire, améliorer ou remplacer les expérimentations animales. 2. Préparation du gradient de Percoll Mélanger 19 ml de 1 x PBS avec 1 ml de PBS 10x, 1 ml de FCS et 10 ml de Percoll. Effectuer sterile filtration dans un tube de verre (diamètre des pores du filtre: 0,2 pm). Ensuite conserver la solution à 4 ° C. 3. Préparation de l'endothélium cellulaire moyen et revêtement des plaques de culture cellulaire Moyenne des cellules endothéliales: Préparation de 500 ml de milieu: (Approx. 20%) Mélanger 400 ml de milieu DMEM (env. 80%) avec 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 ug / ml, environ 0,05%), 0,5 ml d'héparine (100 pl / ml; env. 0,1%) et 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; env. 0,1%). Ajouter pyrumycin seulement pour milieu de culture cellulaire utilisé dans les 2 premiers jours de culture. Effectuer une filtration stérile dans un tube de verre (diamètre des pores du filtre: 0,2 pm). Ensuite conserver la solution à 4 ° C. Revêtement de plaques de culture de cellule: Pour 1 ml de solution de revêtement, préparer une solution de 500 ul trou DDH 2 O, 400 pi de collagène IV (0,4 mg / ml) et 100 ul de fibronectine (0,1 mg / ml). Couvrir toute la surface de l'EACh puits de la plaque de culture de cellules avec la solution de revêtement. Conservez la plaque à 4 ° C pendant la nuit. 4. L'isolement de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau murin (MBMEC) Sacrifiez 10 souris adultes (8 – 12 semaines, C57BL / 6) par dislocation cervicale. Isoler Ensuite, les souris-cerveau et magasin dans 5 ml de PBS (Avertissement: travail stérile). Retirer les tiges cerveau, le cervelet et du thalamus avec une pince. Détachez les méninges en roulant soigneusement le cerveau sur un papier buvard stérile. Recueillir les libres-méninges forebrains résultant. Transférer le cerveau dans un tube Falcon de 50 ml rempli de 13,5 ml de DMEM. Émincer le tissu, avec une première pipette de 25 ml, puis avec une pipette de 10 ml jusqu'à ce que le support devient laiteuse. Puis digérer le tissu avec un mélange de 0,6 ml de collagénase CLS2 (10 mg / ml dans du DMEM) et 0,2 ml de DNAse (1 mg / ml dans du PBS) en milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco pendant 1 heure à 37 ° C sur une orbitale secouerr à 180 rpm. Ajouter 10 ml de DMEM ajoutés à la suspension de tissu et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant (Avertissement: PELLET est facile de perdre) Pour retirer la myéline, la remise en suspension du culot avec une pipette de 25 ml dans 25 ml de DMEM-BSA (20% p / v) (env. 25 fois), et centrifuger à 1000 g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter la couche de myéline supérieure (laiteux) avec un cassé pipette Pasteur en verre avec un diamètre plus grand, et puis jetez la couche de BSA avec une pipette Pasteur normale. Reprendre le culot dans 9 ml de DMEM et ajouter 1 ml de collagénase / dispase (concentration finale est de 1 mg / ml) et 0,1 ml de DNAse. Digérer la solution pendant 1 heure à 37 ° C sur un agitateur orbital à 180 rpm (mise en garde: ne pas utiliser la pipette pour remettre en suspension – les cellules peuvent être perdues). Au cours de la digestion, centrifuger la solution Percoll de mettre en place le gradient de densité en utilisant une ultracentrifugation à 3000 g pendant 1 h à 4 ° C, avec une accélération, wifrein Thout. Ajouter 10 ml de DMEM à la suspension de cellules digérées. Centrifuger la suspension à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. Ensuite, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 2 ml de DMEM. Ajouter les cellules remises en suspension avec soin sur le dessus du gradient de Percoll et centrifuger à 700 g pendant 10 min à 4 ° C sans freinage et accélération. Remarque: Les cellules sont visibles comme un nuage dans l'interphase. Prenez environ. 12 ml de cellules à l'interphase avec une longue aiguille stérile et le placer dans un nouveau 50 ml Falcon avec 5 ml de DMEM. Centrifuger les cellules à nouveau à 1000 g pendant 10 min à 4 ° C. Ensuite remettre en suspension le culot dans le milieu de cellules endothéliales (utiliser env. 0,2 ml de milieu par 1 cm 2 de surface de la cellule plaque de culture). Retirer la solution de revêtement à partir de plaques revêtues de culture de cellules (voir étape 3.2) et rincer chaque puits avec du PBS stérile en deux étapes de lavage consécutives. Maintenir des cultures de cellules endothéliales demilieu cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur stérile. Changer le milieu tous les deux à trois jours. Fractionner les cellules à 90% de confluence.

Representative Results

Immédiatement après l'isolement, BMECs murines et des cellules contaminantes forment des conglomérats qui flottent dans le milieu de culture de cellules (Figure 1A, jour 0). Le traitement avec pyrumycin conduit à une sélection de BMECs murins car elles expriment des niveaux élevés de transporteurs d'efflux tels que les P-glycoprotéine qui conduit à une résistance par rapport à des toxines. Cellules contaminantes sont beaucoup plus sensibles à la cytotoxicité à médiation pyrumycin 19. Pendant le processus de sélection pyrumicin, cellules contaminantes entrent mort cellulaire par apoptose ou nécrose, alors que MBMECs commencent à fixer au collagène IV / fibronectine enduit culture cellulaire plaques (figure 1A, jours 1 et 2). Jusqu'à ce jour 5, les MBMECs prolifèrent jusqu'à une densité d'env. 80 – 90%. Ils sont caractérisés par l'aspect typique en forme de fuseau. A confluence, elles forment une monocouche de serrés, alignés longitudinalement et les cellules de contact inhibée sans chevauchement (figure 1A, le jour 5). Parsélection pyrumicin, un haut degré de pureté de 99% MBMEC est atteint comme en témoigne le marqueur CD31 des cellules endothéliales (PECAM1, figure 1B). Les MBMECs forment bien monocouches étanches reliés entre eux par des protéines des jonctions serrées. Après 7 – 8 jours de culture, les couches de cellules endothéliales accumulent des valeurs stables pour la résistance électrique (atteignant des valeurs typiques entre 20 à 30 Ω x cm 2). Et la capacité (figure 1C) À ce point dans le temps des tests fonctionnels tels que Cell- expériences de migration 3, 20,21 et perméabilité des tests, par exemple avec du bleu d'Evans ou de dextran, doivent être effectuées. Figure 1. morphologique et les propriétés fonctionnelles de murin BMECs. (A) évolution dans le temps représentant de BMECs culture consultés par micro lumière de transmissionSCOPY plus de 5 jours. La barre d'échelle est valable pour toutes les images. (B) coloration par immunofluorescence pour le endothéliale marqueur de cellules CD31 au jour 5. CD31 (vert) et DAPI (bleu). (C) Les cellules ont été pré-cultivés pendant 5 jours et ensuite transférés à un système automatisé pour la l'analyse des propriétés biophysiques (résistance et capacité). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dysfonctionnement sang-cerveau-barrière est une marque de diverses maladies délétères du SNC, par exemple une panne de la BHE dans la sclérose en plaques facilite largement l'invasion du système nerveux central par les cellules immunitaires autoréactives et permet la rencontre et la destruction des oligodendrocytes. Dans un AVC ischémique la perturbation de la BHE et la formation subséquente de l'oedème cérébral sont des facteurs essentiels qui influencent la croissance de l'infarctus secondaire et la survie globale des patients 6. En outre, par des altérations de la BHE dans les régions éloignées des lésions ischémiques focaux sont capables d'induire des altérations fonctionnelles généralisées du cerveau. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont largement inconnus 5. En revanche, la densité élevée et de la diversité des transporteurs d'efflux dans BMECs fonctionnels réduit la concentration de médicaments utiles comme agents chimiothérapeutiques pour les tumeurs malignes du cerveau ou des antibiotiques pour les maladies infectieuses. Par conséquent, une meilleure compréhension de la cerveau-bar de sangrier fonction dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est nécessaire de développer des agents pharmacologiques qui sont capables de réguler spécifiquement la fonction de barrière dans la direction privilégiée 21. Fiable dans des modèles in vitro de la BHE sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes de régulation de la BHE.

De nombreuses lignées cellulaires immortalisées endothéliale du cerveau ont été créés et utilisés comme des modèles in vitro 22 BBB. Ces lignées cellulaires offrent certains avantages par rapport BMECs primaires à mesure qu'ils grandissent plus vite et de garder certaines caractéristiques de BBB sur plusieurs passages. Cependant, les lignées cellulaires endothéliales ne peuvent se substituer entièrement à cellules primaires propriétés importants sont modifiés qui se mêlent à la transférabilité des résultats expérimentaux à la situation in vivo. Par exemple, la lignée de cellules endotheliales de cerveau murin bEnd.5 exprime uniquement de faibles taux de protéines de jonctions serrées répartis de façon discontinue conduisant à haute Paracperméabilité ellular 23. BEnd.3, une autre ligne fréquemment utilisé cellule endothéliale du cerveau de souris, démontre jonctions denses et continues distribués serrés, une résistance transendothéliale haut, plusieurs transporteurs d'efflux et la faible perméabilité paracellulaire. Cependant, les couches de cellules bEnd.3 rapport à BMECs primaires manquent d'une véritable discrimination à l'égard de la pénétration de certains transcellulaire et substrats paracellulaires 24.

Dans les préparations de cultures de cellules primaires, cellules contaminantes peuvent interférer de façon significative avec la validité des résultats expérimentaux. Dans le protocole décrit, pyrumicin est utilisée comme agent sélectif pour les cellules endotheliales d'atteindre une pureté élevée. Cependant, un contrôle de la qualité régulière de la culture cellulaire est inévitablement nécessaire pour garantir des expériences fiables. Il existe plusieurs méthodes pour le contrôle de la qualité, en plus de propriétés morphologiques typiques des cellules endothéliales (voir figure 1A), la transendothelial résistance peut être mesurée ou l'expression du marqueur de cellules endotheliales tels que CD31 (voir figure 1B) ou le facteur de von Willebrand (vWF) peut être évaluée.

Le nombre de cellules endothéliales cérébrales isolées d'un cerveau de souris est relativement faible et de mettre en place une culture de cellules approprié pour de multiples expériences, le cerveau de plusieurs souris doivent être mis en commun. Dans notre expérience, au moins 10 souris doivent être utilisées pour une expérience qui pourrait être un facteur limitant en fonction des ressources de l'animalerie respectif. Afin d'éviter les biais ou les facteurs de confusion, seules les souris avec un fond génétique et de l'environnement devraient être mis en commun identique. En revanche, les bovins et les préparations de cellules endothéliales de cerveau de porc fournissent un grand nombre de cellules endothéliales de cerveau disponibles dans un cerveau. Cependant, outre la reproduction simple et le logement, le répertoire large et de plus en plus de souris transgéniques disponibles rend murine primaire BMECs comme un idéalmodèle pour étudier la fonction sang-cerveau-barrière.

Plusieurs résultats importants concernant les fonctions de la BHE et les mécanismes moléculaires sous-jacents sont venus des études en 2D systèmes de culture de tissu. Récemment, des systèmes de culture en 3D ont été mis au point 25, où les cellules endothéliales sont placées dans une matrice de collagène qui leur permet de former la lumière et des réseaux tubulaires. Ces nouveaux systèmes de culture de cellules pour permettre une reproduction plus fidèle de processus vasculaires dans l'organisme intact in vivo. L'implication des autres cellules de l'NVU en 3D des systèmes de culture cellulaire, tels que les péricytes et les astrocytes peut révolutionner l'étude in vitro de la fonction hémato-encéphalique barrière; premiers modèles ont été développés récemment 26.

Il ya quelques recommandations pour le dépannage. Tout d'abord travail stérile est essentielle pour la qualité de la culture des cellules endothéliales. Deuxièmement, pyrumycin ne doit être ajouté pour cellulairemilieu de culture utilisé dans les 2 premiers jours de culture, plus l'application peut conduire à la mort cellulaire accrue MBMEC et la fonction barrière de faible qualité. Troisièmement, les enzymes utilisées dans ce protocole doivent être utilisées et stockées selon les instructions du fabricant; autrement leur bon fonctionnement peut être compromise. En outre, le revêtement de plaques de culture de cellules peut être modifié si les cellules endothéliales ne se fixent pas. Les concentrations de la fibronectine et du collagène peuvent être modifiées ou d'autres protéines de la matrice peuvent être ajoutés à la solution de revêtement. Enfin, l'âge, le sexe, la saison de l'année et les conditions environnementales au sein de l'animalerie sont des facteurs importants qui pourraient influer sur la qualité de MBMEC isolement et la comparabilité des expériences. Il faut veiller à ce que les conditions sont comparables entre expériences indépendantes.

Le protocole décrit doit être considéré comme une méthode de base pour isoler neuroimmunologiques BMECs murins. Les cellules isolées peuvent être used pour une grande variété d'applications pour mieux comprendre en fonction BBB, comme les essais de migration, gène et les études d'expression de protéines, des évaluations ou des expériences électrophysiologiques de perméabilité. Comme mentionné ci-dessus, 3D systèmes de culture de cellules de BMECs pourraient offrir de nouvelles possibilités pour étudier les mécanismes complexes impliqués dans la régulation de la BHE dans le contexte de la NVU. Par conséquent, l'isolement de cellules endothéliales primaires restera une technique précieuse dans le domaine de la recherche BBB dans l'avenir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), cellules en mouvement Cluster d'excellence (EXC 1003 – CIM), l'Université de Münster (SB et SGM) et par la Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 à SB et SGM). Nous remercions Heike Blum pour les excellentes illustrations.

Materials

bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A9418 Bovine serum albumine
Collagenase CLS2 Worthington LS004176 High relative level of protease activity
Collagenase-dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV Sigma Aldrich C0543 From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM Sigma Aldrich D5030 Warm in 37 °C water bath before use
DNAse Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin Sigma Aldrich H3393 Anticoagulant
PDS First Link UK Ltd. 60-00-850 Plasma-derived serum
Percoll Sigma Aldrich P1644 Warm to room temperature before use
Pyrumycin Sigma Aldrich P8833 Should only be used in first 2 d of culture
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References

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Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (93), e52204, doi:10.3791/52204 (2014).
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