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Neuroscience

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Published: November 14, 2014
doi:
10.3791/52204
, , , ,
1Department of Neurology,University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I,University of Münster

Summary

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Abstract

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.

Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.

This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Introduction

Cervello microvascolare cellule endoteliali (BMEC) formano monostrati che sono parte integrante della ematoencefalica barriera altamente specializzato (BBB). BMECs sono interconnessi da proteine ​​giunzionali attaccato ad una membrana basale. Insieme con periciti, cellule muscolari lisce, i piedi di fascia astrociti e cellule circolanti del sangue si accumulano i cosiddetti unità neurovascolare (NVU) 1. Contro il concetto precedente di una barriera impermeabile tra il sangue e il nervoso centrale (SNC), il NVU è un'interfaccia dinamica, altamente specifico e regolato che controlla il passaggio di fluidi, molecole e cellule tra vasi sanguigni cerebrali e del SNC 2 . Una disfunzione o disregolazione del NVU possono avviare e / o contribuire ad una varietà di neurovascolari, malattie infettive, infiammatorie o degenerative del sistema nervoso centrale, come l'ictus ischemico, l'HIV-encefalopatia, la sclerosi multipla, il morbo di Alzheimer o di Parkinson malattia 3-6.

_content "> Il monostrato BMEC è chiuso ermeticamente da un complesso giunzionale costituito di tenuta (TJ) e giunzioni aderenti (AJ) 7. L'elevata resistenza elettrica e la bassa permeabilità paracellulare della BBB si basano principalmente sulle proteine ​​TJ 8. Le TJs sono complessi formati dalle proteine ​​transmembrana della famiglia Claudin e occludina, che sono collegati al citoscheletro delle cellule endoteliali da molecole adattatori, quali le zonulaoccludens (ZO) proteine ​​ZO1-3 4. giunzioni aderenti sono assemblati principalmente dalla proteina integrale di membrana vascolare endoteliale (VE) -cadherin, che è legata al citoscheletro tramite catenine 8.

La stretta tenuta della BBB impedisce il libero scambio di substrati e cellule tra il sangue e nel liquor. Le eccezioni a questa regola sono lipofile, piccole molecole di peso molecolare <400 Da, che sono in grado di attraversare la BBB da lipidica mediata diffusione 9. Il passaggio di grandi e / omolecole idrofile, come il glucosio, aminoacidi, peptidi, proteine ​​e molti farmaci è limitata a sistemi altamente controllati transcellulare di trasporto 10, che possono essere classificati in cinque categorie principali: trasporto carrier-mediato, trasporto di ioni, trasporti efflusso attivo, mediata da recettori trasporti, e caveole mediata trasporto 4. Questi sistemi trasportatori aiutano mantenere l'omeostasi del sistema nervoso centrale, che è richiesto per una generazione del segnale accurata, trasduzione e integrazione. Inoltre, BMECs sono in grado di controllare attivamente il passaggio di molecole distinte mediante l'espressione di una varietà di ectoenzimi. Questi enzimi sono localizzati sulla superficie cellulare e modificare substrati endogeni ed esogeni specifici impedire o consentire il passaggio della BBB 11.

Considerando che il sistema nervoso centrale è stato considerato come un organo immunitario privilegiato per un lungo tempo, i recenti risultati suggeriscono un sistema piuttosto dinamico e strettamente regolamentato di Surv immunitarioeillance del SNC. I BMECs sono criticamente coinvolti nella regolazione della trasmigrazione delle cellule immunitarie. Con l'espressione delle selectine sulle loro linfociti superficie selettivamente indotto a fissare liberamente per l'endotelio. La secrezione di chemochine che incontrano con specifici recettori sui leucociti conduce all'espressione o cambiamenti conformazionali di integrine leucocitarie, come LFA-1 (funzione associato al linfocita-1) e VLA-4 (molto tardi antigene-4). Le integrine mediano una ferma adesione legandosi loro counterreceptors endoteliali, ad esempio, VCAM-I (molecola di adesione delle cellule vascolari), ICAM-I (molecola di adesione intercellulare) che permettono la trasmigrazione nel parenchima cerebrale fra o attraverso BMECs della BBB 12-14. Questi e altri risultati sottolineano il ruolo attivo dell'endotelio stesso nella regolazione della migrazione delle cellule immunitarie.

Inoltre, BMECs come parte del NVU sono coinvolti nella regolazione del flusso ematico cerebrale linked alle richieste metaboliche neuronali locali. Dopo la stimolazione astrociti cellule endoteliali producono sostanze vasoattive come l'ossido nitrico che porta al rilassamento delle cellule muscolari lisce vascolari 15.

L'angiogenesi e neurogenesi nella sviluppo e nell'adulto mostra cervello patterning e sviluppo parallelo e condividere molte proprietà di regolazione 1, 4. Le cellule endoteliali sono criticamente coinvolte in questi processi 16, 17.

In sintesi, BMECs fornire caratteristiche essenziali per garantire un corretto sviluppo e funzionamento del sistema nervoso centrale. La disfunzione BBB è legato a molti gravi disturbi neurologici. Tuttavia, solo pochi obiettivi sono stati identificati a livello di interfaccia cervello-vascolare per il trattamento specifico ed efficace 18. Semplificata in modelli in vitro sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi coinvolti nella funzione e la regolazione di sistemi fisiologici complessi per lotempo ng. L'isolamento come descritto da questo manoscritto e lo studio in vitro di murino BMECs, data la grande varietà di specifiche topo knockout-ceppi, potrebbe fornire una maggiore comprensione della funzione BBB e regolazione in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche aprono nuove strade terapeutiche.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità locali ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW, Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Germania") e condotto secondo la legge tedesca di protezione degli animali. 1. Osservazioni generali per esperimenti mouse Eseguire tutti gli esperimenti con i topi in conformità con le linee guida del rispettivo Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso. Tenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e consentire loro di avere accesso a cibo e acqua ad libitum. Utilizzare i topi per età e sesso nei gruppi trattati perché le proprietà biologiche può variare con l'età e il sesso. Per quanto possibile cercare di ridurre, perfezionare o sostituire gli esperimenti sugli animali. 2. Preparazione del gradiente Percoll Mescolare 19 ml di PBS 1x con 1 ml di PBS 10x, 1 ml FCS e 10 ml di Percoll. Eseguire sterile filtrazione in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 micron). Successivamente conservare la soluzione a 4 ° C. 3. Preparazione del mezzo endotelio cellulare e rivestimento delle piastre di coltura cellulare Media delle cellule endoteliali: Preparazione del mezzo 500 ml: (. Circa 20%) Miscelare 400 ml di terreno DMEM (. Circa 80%) con 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml, circa 0,05%), 0,5 ml di eparina (100 microlitri / mi;. circa 0,1%) e 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. circa 0,1%). Aggiungere pyrumycin solo per mezzo di coltura cellulare usato nei primi 2 giorni di coltura. Eseguire filtrazione sterile in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 micron). Successivamente conservare la soluzione a 4 ° C. Rivestimento di piastre di colture cellulari: Ad 1 ml di soluzione di rivestimento, preparare una soluzione di 500 microlitri DDH 2 O, 400 microlitri collagene IV (0,4 mg / ml) e 100 ml di fibronectina (0,1 mg / ml). Coprire tutta la superficie di each pozzetto della piastra di coltura cellulare con la soluzione di rivestimento. Conservare la piastra a 4 ° C per una notte. 4. L'isolamento di cellule endoteliali murine Cervello microvascolari (MBMEC) Sacrifica 10 topi adulti (8 – 12 settimane di vita, C57BL / 6) per dislocazione cervicale. Successivamente isolare i mouse-cervello e conservare in 5 ml di PBS (Caveat: lavoro sterile). Rimuovere cervello steli, cerebella e talami con una pinza. Staccare meningi facendo rotolare con cura il cervello su una carta assorbente sterile. Raccogliere le conseguenti free-meningi forebrains. Trasferire il cervello di un tubo da 50 ml Falcon riempito con 13,5 ml di DMEM. Macinare il tessuto, prima con una pipetta 25 ml, poi con una pipetta 10 ml fino alla media diventa lattiginoso. Poi digerire il tessuto con una miscela di 0,6 ml di collagenasi CLS2 (10 mg / ml in DMEM) e 0,2 ml di DNAsi (1 mg / ml in PBS) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) per 1 ora a 37 ° C su un orbitale scuoterer a 180 rpm. Aggiungere 10 ml di DMEM aggiunti alla sospensione di tessuto e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante (Caveat: PELLET è facile perdere) Per rimuovere la mielina, risospendere il pellet con una pipetta 25 ml in 25 ml di BSA-DMEM (20% w / v) (circa. 25 volte), e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Eliminare lo strato di mielina superiore (latte) con una rotta pipetta Pasteur di vetro con diametro maggiore, e quindi eliminare lo strato di BSA con una normale pipetta Pasteur. Risospendere il pellet in 9 ml di DMEM ed aggiungere 1 ml di collagenasi / dispasi (concentrazione finale di 1 mg / ml) e 0,1 ml di DNAsi. Digerire la soluzione per 1 ora a 37 ° C in un agitatore orbitale a 180 giri al minuto (avvertimento: non utilizzare la pipetta per sospendere di nuovo – le cellule possono essere persi). Durante la digestione, centrifugare la soluzione Percoll per impostare il gradiente di densità utilizzando un'ultracentrifuga a 3.000 xg per 1 ora a 4 ° C, con accelerazione, wisarie, senza freno. Aggiungere 10 ml di DMEM alla sospensione cellulare digerito. Centrifugare la sospensione a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. Poi scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM. Aggiungere le cellule risospese attenzione sulla parte superiore del gradiente di Percoll e centrifugare a 700 xg per 10 min a 4 ° C senza accelerazione e frenatura. Nota: Le celle sono visibili come una nuvola in interfase. Prendete circa. 12 ml di interfase con le cellule con un lungo ago sterile e posizionarlo in una nuova Falcon da 50 ml con 5 ml di DMEM. Centrifugare le cellule di nuovo a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. Successivamente risospendere il pellet in mezzo delle cellule endoteliali (utilizzare circa. 0,2 ml di terreno per 1 cm 2 di superficie della piastra di coltura cellulare). Rimuovere la soluzione di rivestimento da piastre di coltura di cellule rivestite (vedere il punto 3.2) e sciacquare ogni bene con PBS sterile in due fasi di lavaggio consecutive. Mantenere colture cellulari in endotelialemedio cella a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore sterile. Cambiare la media ogni due o tre giorni. Celle divise al 90% di confluenza.

Representative Results

Subito dopo l'isolamento, BMECs murine e cellule contaminanti formano conglomerati galleggianti nel mezzo di coltura cellulare (Figura 1A, giorno 0). Il trattamento con pyrumycin porta ad una selezione di BMECs murini quanto esprimono elevati livelli di trasportatori di efflusso quali la P-glicoproteina portando ad una relativa resistenza alle tossine. Cellule contaminanti sono molto più sensibili a pyrumycin citotossicità mediata 19. Durante il processo di selezione pyrumicin, cellule contaminanti entrano morte cellulare per apoptosi o necrosi, mentre MBMECs cominciano ad allegare al collagene IV / fibronectina rivestite con piastre di coltura cellulare (Figura 1A, il giorno 1 e il giorno 2). Fino al giorno 5, i MBMECs proliferano ad una densità di circa. 80-90%. Sono caratterizzati dal tipico aspetto a forma di fuso. Alla confluenza, formano un monostrato di contatto inibito cellule non sovrapposte ravvicinate, allineati longitudinalmente e (Figura 1A, il giorno 5). Daselezione pyrumicin, un'elevata purezza di fino al 99% MBMEC è raggiunto come dimostra il marker endoteliale CD31 (PECAM1; Figura 1B). I MBMECs formano monostrati ben sigillati tra loro da proteine ​​di giunzione stretti. Dopo 7 – 8 giorni di coltura, gli strati di cellule endoteliali accumulano valori stabili per resistenza elettrica (raggiungendo valori tipici tra 20 – 30 che Ω x cm 2). E capacità (Figura 1C) A questo punto test funzionali quali cellulo esperimenti di migrazione 3, 20,21 e permeabilità test, ad esempio con il blu di Evans o destrano, devono essere eseguiti. Figura 1. morfologiche e funzionali di Murine BMECs. (A) andamento temporale Rappresentante di BMECs coltivate visti di trasmissione della luce microSCOPY più di 5 giorni. Barra di scala vale per tutte le immagini. (B) colorazione immunofluorescenza per il marcatore delle cellule endoteliali CD31 al giorno 5. CD31 (verde) e DAPI (blu). (C) Le cellule sono state precultured per 5 giorni e poi trasferiti ad un sistema automatizzato per la analisi delle proprietà biofisiche (resistenza e capacità). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Disfunzioni emato-encefalica-barriera è un marchio di garanzia di varie malattie deleteri sul sistema nervoso centrale, ad esempio una ripartizione della BBB nella sclerosi multipla facilita ampiamente l'invasione del sistema nervoso centrale da parte delle cellule immunitarie autoreattive e permette l'incontro e la distruzione degli oligodendrociti. In ictus ischemico l'interruzione della BBB e la successiva formazione di edema cerebrale sono fattori critici che influenzano la crescita infarto secondario e la sopravvivenza globale dei pazienti 6. Inoltre, da alterazioni della BBB in aree remote lesioni ischemiche focali sono in grado di indurre diffuse alterazioni funzionali del cervello. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base sono in gran parte sconosciuti 5. Al contrario, l'alta densità e la diversità dei trasportatori di efflusso in BMECs funzionali riduce la concentrazione di farmaci benefici come chemioterapici per tumori maligni del cervello o di antibiotici per le malattie infettive. Di conseguenza, una più profonda comprensione del sangue-cervello-barÈ necessario rier funzione in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche per sviluppare agenti farmacologici in grado di regolare specificamente la funzione barriera nella direzione favorita 21. Affidabile in modelli in vitro di BBB sono strumenti indispensabili per lo studio dei meccanismi di regolamentazione a BBB.

Molte linee di cellule endoteliali cerebrali immortalati sono stati stabiliti e impiegati come modelli in vitro di BBB 22. Queste linee cellulari offrono alcuni vantaggi rispetto BMECs primarie man mano che crescono più velocemente e mantengono alcune caratteristiche BBB nell'arco di diversi passaggi. Tuttavia, le linee di cellule endoteliali non possono sostituire in toto per le cellule primarie proprietà come importanti sono modificati che si mescolano con la trasferibilità dei risultati sperimentali alla situazione in vivo. Ad esempio, la linea cellulare endoteliale cervello murino bEnd.5 esprime solo bassi livelli di proteine ​​di giunzione stretti discontinuo distribuiti portano a alto Paracpermeabilità ellular 23. BEnd.3, un'altra linea di cellule murine endoteliali cerebrali di uso frequente, dimostra giunzioni densi e continui distribuiti stretti, una elevata resistenza transendoteliale, diversi trasportatori di efflusso e bassa permeabilità paracellulare. Tuttavia, strati cellulari bEND.3 confrontati BMECs primari mancano di una vera discriminazione rispetto alla permeazione di alcuni transcellulare e substrati paracellular 24.

Nelle preparazioni di colture cellulari primarie, cellule contaminanti possono interferire in modo significativo con la validità dei risultati sperimentali. Nel protocollo descritto, pyrumicin viene usato come agente selettivo per cellule endoteliali di raggiungere elevata purezza. Tuttavia, un controllo regolare della qualità della coltura cellulare è inevitabilmente necessario per garantire per esperimenti affidabili. Ci sono diversi metodi per il controllo qualità, oltre a tipiche caratteristiche morfologiche delle cellule endoteliali (Figura 1A), il transendotheliaresistenza l può essere misurato o l'espressione del marcatore delle cellule endoteliali come CD31 (Figura 1B) o il fattore di von Willebrand (vWF) potrebbe essere valutata.

Il numero di cellule endoteliali cerebrali isolate da un cervello di topo è relativamente basso e di creare una coltura cellulare adeguata per più esperimenti, il cervello dei topi diversi devono essere messe in comune. Nella nostra esperienza, almeno 10 topi devono essere utilizzati per un esperimento che potrebbe essere un fattore limitante seconda delle risorse dei rispettivi stabulario. Al fine di evitare distorsioni o fattori confondenti, solo i topi con un background genetico e ambientale identiche dovrebbero essere messe in comune. Al contrario, bovini e preparazioni di cellule endoteliali cerebrali suine fornire un gran numero di cellule endoteliali cerebrali disponibili in un cervello. Tuttavia, oltre il semplice allevamento e l'alloggiamento, il repertorio ampio e sempre crescente di topi transgenici rende disponibili murino primario BMECs come idealemodello per studiare la funzione emato-encefalica Barriera.

Diversi risultati fondamentali riguardanti le funzioni del BBB e dei meccanismi molecolari alla base provengono da studi in sistemi di coltura di tessuti 2D. Recentemente, sistemi di coltura 3D sono stati sviluppati 25, in cui le cellule endoteliali sono collocati all'interno di una matrice di collagene che consenta loro di formare lume e reti tubolari. Questi nuovi sistemi di coltura cellulare consentono una riproduzione ancora più precisa dei processi vascolari nell'organismo integro in vivo. Il coinvolgimento di ulteriori cellule dei NVU in 3D sistemi di colture cellulari, come i periciti e astrociti potrebbe rivoluzionare in vitro studio della funzione emato-encefalica Barriera; primi modelli sono stati recentemente sviluppati 26.

Ci sono alcune raccomandazioni per la risoluzione dei problemi. Innanzitutto lavoro sterile è essenziale per la qualità della coltura di cellule endoteliali. In secondo luogo, pyrumycin deve essere aggiunto solo per cellulareterreno di coltura utilizzato nei primi 2 giorni di coltura, l'applicazione più lungo potrebbe portare ad un aumento della morte cellulare MBMEC e la funzione di barriera bassa qualità. In terzo luogo, gli enzimi applicati in questo protocollo devono essere utilizzati e conservati secondo le istruzioni del fabbricante; altrimenti la loro funzione potrebbe essere compromessa. Inoltre, il rivestimento delle piastre di coltura di cellule potrebbe essere modificata se le cellule endoteliali non attribuiscono. Le concentrazioni di fibronectina e collagene potrebbero essere modificati o altre proteine ​​della matrice possono essere aggiunti alla soluzione di rivestimento. Infine, l'età, il sesso, la stagione delle condizioni anno e ambientali all'interno della struttura degli animali sono fattori importanti che potrebbero influenzare la qualità di isolamento MBMEC e comparabilità degli esperimenti. Occorre garantire che le condizioni siano comparabili tra esperimenti indipendenti.

Il protocollo descritto dovrebbe essere considerato come un metodo neuroimmunologica base per isolare BMECs murini. Le cellule isolate possono essere used per una vasta gamma di applicazioni per ottenere una visione più completa funzione BBB, come ad esempio test di migrazione, genetica e studi di espressione di proteine, valutazioni elettrofisiologiche o esperimenti di permeabilità. Come accennato in precedenza, i sistemi di coltura cellulare 3D di BMECs potrebbero fornire nuove opportunità per studiare i complessi meccanismi coinvolti nella regolazione della BBB nel contesto del NVU. Pertanto, l'isolamento delle cellule endoteliali primarie rimarrà una tecnica prezioso nel campo della ricerca BBB in futuro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Celle-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 – CIM), Università di Muenster (a SB e SGM) e dalla Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB e SGM). Ringraziamo Heike Blum per le ottime illustrazioni.

Materials

bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A9418 Bovine serum albumine
Collagenase CLS2 Worthington LS004176 High relative level of protease activity
Collagenase-dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV Sigma Aldrich C0543 From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM Sigma Aldrich D5030 Warm in 37 °C water bath before use
DNAse Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin Sigma Aldrich H3393 Anticoagulant
PDS First Link UK Ltd. 60-00-850 Plasma-derived serum
Percoll Sigma Aldrich P1644 Warm to room temperature before use
Pyrumycin Sigma Aldrich P8833 Should only be used in first 2 d of culture
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References

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Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (93), e52204, doi:10.3791/52204 (2014).
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