Purification à grande échelle d'origine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien

Dans la rétine, la vision est provoquée par isomérisation des molécules photosensibles appelées opsines, avant d'être transformé en un signal qui peut être transmis entre les neurones jusqu'à des zones visuelles du cerveau. Ces molécules sont intégrées dans des piles de disques membraneuses ressemblant à crêpes qui constituent les parties de segments extérieurs des cellules photoréceptrices (PR). Être soumis à une exposition constante à des niveaux considérables donc du stress oxydatif et de la lumière, les PR renouveler continuellement leurs segments extérieurs à limiter les dommages oxydatifs potentiel. Photoréceptrices segments extérieurs sont en contact étroit avec microvillosités apicale des cellules voisines épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Cellules RPE constitue la partie extérieure de la barrière hémato-rétinienne et assurent de nombreuses tâches qui sont cruciaux pour photorécepteurs santé et de la fonction ^1, telles que la trempe des rayons lumineux par l'intermédiaire de pigments mélaniques, re-isomérisation du photoréactif rétine de composante de opsine, fournissant des nutriments et de gCROISSANCE facteurs, en participant à l'élimination PR métabolite.

En outre, les cellules RPE éliminent passé POS et recyclent leurs composants, une occupation quotidienne qui est réglementée par le rythme circadien dans la rétine des mammifères ^2,3. La clairance du hangar POS est absolument nécessaire pour la survie de PR. Quand il est complètement abrogée, les débris se accumulent POS et PRS dégénèrent provoquant rapide de ^4,5 perte de vision. Si le profil rythmique est perdu et remplacé par une activité constante, PR et RPE défauts se accumulent avec l'âge de ^6. Par conséquent, il est très important de caractériser la régulation moléculaire d'un EPR phagocytose in vitro afin de comprendre phénotypes liés à son dysfonctionnement. Fait intéressant, la machinerie moléculaire dans les cellules RPE est très similaire à celle utilisée par les macrophages pour effacer les cellules apoptotiques et les deux dépendent de la reconnaissance de la phosphatidylsérine exposée sur les débris phagocytaire ^9.7. Pourtant, les cellules macrophages et RPE réguler le pHagocytosis différemment, comme les macrophages optent pour l'élimination immédiate de cellules apoptotiques au moment de la rencontre tandis que les cellules RPE engloutir rythmiquement POS seulement une fois par jour en dépit de leur contact permanent avec des segments extérieurs. Cela suggère des mécanismes de régulation spécifiques qui ne sont pas encore bien compris.

Un grand nombre de molécules impliquées dans le mécanisme de phagocytose RPE ont été identifiés validé ou grâce à l'utilisation de POS isolé et culture de cellules tests de phagocytose. Le récepteur d'intégrine alphavbeta5 située à la surface apicale des cellules RPE, en coordination avec son ligand MFG-E8, se lie spécifiquement à POS ^10-12, qui sont ensuite internalisée par l'intermédiaire du récepteur de kinase de tyrosine MerTK ^13-15. Le récepteur scavenger CD36 a été montré pour participer à la prise de point de vente et d'influer sur sa vitesse ^16,17 et peut servir de capteur de phospholipides oxydés à la surface de ¹⁸ points de vente. L'internalisation doit le recrutement de F-cytosquelette d'actine-assdes protéines telles que l'annexine ociated 2 ^19, la myosine II ²⁰ et de la myosine VIIA ^21,22. POS native ou oxydée in vitro sont également utilisés pour comprendre le vieillissement phénotypes de cellules RPE in vivo liés à l'accumulation de mal digéré POS oxydé ^23-28. La génération de cellules RPE dérivées de cellules souches a lancé une nouvelle application pour POS isolé qui sont utilisés pour prouver la fonctionnalité des cellules avant qu'elles sont transplantées à des animaux ou patients ^29,30,27.

Première décrit par Molday et ses collègues en 1987 ^31, le protocole pour l'isolement de POS bovine combine une étape d'ultracentrifugation d'homogénats rétiniennes sur des gradients de saccharose continues avec l'observation de l'apparition d'orange caractéristique de la rétine photopigment écrus (portant 11- rétinien cis). Au cours des 10 dernières années, en raison de précautions prises afin de minimiser le risque de maladie de la vache folle, l'utilisation des yeux porcins est devenu increasingly important. Le protocole décrit ici montre comment obtenir de grandes quantités de POS de porc ou les yeux bovins qui peuvent être aliquotés et conservés pendant de longues périodes de temps. Ceci élimine la nécessité de préparer POS des regards de rongeurs, ce qui nécessite l'aide d'un grand nombre d'animaux par la préparation de POS et le dosage ^32,33,21,22. En outre, des détails concernant l'étiquetage POS avant stockage en utilisant des molécules fluorescentes sont données, pour quantifier et visualiser POS de manière simplifiée et comparables pour certaines applications par rapport à l'étiquetage POS après l'essai de phagocytose ^32,10. Par conséquent, ces stocks importants pour permettre la reproductibilité et la facilité d'utilisation dans de nombreux types d'expériences.