Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

Na retina, a visão é desencadeada por isomerização de moléculas fotossensíveis chamados opsinas, antes de ser transformado em um sinal que pode ser transmitido entre os neurónios para cima para as áreas visuais no cérebro. Estas moléculas são incorporados em pilhas de discos que se assemelham panquecas membranosas que constituem as partes segmentares exterior de células fotorreceptoras (RP). Sendo submetido a constante exposição à luz e, portanto, os níveis consideráveis ​​de estresse oxidativo, PRs renovar continuamente os seus segmentos externos para limitar o dano oxidativo potencial. Segmentos externos fotorreceptoras estão em contato próximo com microvilosidades apical das células do epitélio pigmentado da retina vizinhos (RPE). Células RPE constituem a parte exterior da barreira hemato-retiniana e garantir inúmeras tarefas que são cruciais para fotorreceptores saúde e função ^1, como o que extingue os raios de luz através de pigmentos de melanina, re-isomerização do retinal componente opsina fotorreactivo, fornecendo nutrientes e gCRESCIMENTO fatores, participando de eliminação PR metabólito.

Além disso, as células de RPE eliminam gasto POS e reciclar seus componentes, uma ocupação diária, que é regulada pelo ritmo circadiano na retina de mamíferos ^2,3. A folga de galpão POS é absolutamente necessário para a sobrevivência PR. Quando ele está completamente revogada, POS detritos se acumulam e PRs degenerar causando ^4,5 perda de visão rápida. Se o perfil rítmico é perdida e substituída por uma actividade constante, defeitos PR e RPE acumular com ⁶ anos ^de idade. Portanto, é muito importante para caracterizar a regulação molecular de EPR fagocitose in vitro, a fim de compreender fenótipos ligados à sua disfunção. Curiosamente, a maquinaria molecular em células RPE é muito semelhante à utilizada pelos macrófagos para eliminar as células apoptóticas e ambos dependem do reconhecimento de fosfatidilserina exposta em detritos fagocítica ^7-9. Ainda, as células de RPE e macrófagos regular o pHagocytosis de forma diferente, como macrófagos optar pela eliminação imediata das células em apoptose em tempo de encontro, enquanto as células RPE ritmicamente engolfar POS apenas uma vez por dia, apesar de estarem em contato permanente com segmentos externos. Isto sugere mecanismos de regulação específicos que ainda não são totalmente compreendidos.

Muitas das moléculas envolvidas na maquinaria de EPR fagocítica foram identificados e validados graças à utilização de POS isolado e ensaios de fagocitose de cultura de células. O receptor de integrina alphavbeta5 localizado na superfície apical de células RPE, em coordenação com o seu ligando MFG-E8, liga-se especificamente ao POS ^10-12, que são então internalizado através do receptor tirosina-quinase MerTK ^13-15. O scavenger receptor CD36 tem sido mostrado para participar na ingestão de POS e influenciar a sua velocidade de ^16,17, e poderá servir como um sensor de fosfolípidos oxidados na superfície POS ^18. Internalização precisa o recrutamento de F-citoesqueleto de actina-assproteínas, tais como a anexina ociated 2 ^{19, 20} e miosina II miosina VIIA ^21,22. POS Native ou oxidado in vitro também são utilizados para entender o envelhecimento fenótipos de células RPE in vivo ligados ao acúmulo de mal digeridos POS oxidado ^23-28. A geração de células epiteliais pigmentares derivadas de células-tronco deu início a uma nova aplicação para o isolado POS que são usados ​​para provar a funcionalidade das células antes de serem transplantadas para animais ou pacientes ^29,30,27.

Descrita pela primeira vez por Molday e colegas em 1987, ^31, o protocolo para o isolamento de POS bovina combina um passo ultracentrifugação de homogeneizados de retina em gradientes de sacarose contínuas com observação da aparência laranja característico de fotopigmento retinal crus (levando 11- retinal cis). Nos últimos 10 anos, devido a precauções tomadas, a fim de minimizar o risco de doença da vaca louca, o uso de olhos de porco tornou-se increasingly proeminente. O protocolo aqui descrito mostra como obter grandes quantidades de POS de porcina ou bovina olhos que podem ser distribuídos em alíquotas e armazenados por longos períodos de tempo. Isto elimina a necessidade de preparar a partir de POS de roedores olhos, o que exige a utilização de um grande número de animais em cada preparação e ensaio de POS ^32,33,21,22. Além disso, detalhes sobre rotulagem POS antes de armazenamento utilizando moléculas fluorescentes são dadas, para quantificar e visualizar POS de uma forma simplificada e comparáveis ​​para algumas aplicações, em comparação com a rotulagem POS após o ensaio de fagocitose ^32,10. Portanto, estes grandes existências permitir a reprodutibilidade e facilidade de utilização, em muitos tipos diferentes de experiências.