واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية
Summary
This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.
Abstract
تحليل واحدة من الوظائف الحيوية للشبكية العين الظهارية الصباغ (RPE) خلايا، والبلعمة من قضى شظايا البعيدة هرمة مبصرة شرائح الخارجية (POS) لا يمكن أن يؤديها في المختبر. مبصرة شرائح الخارجي مع أكوام من أقراص غشائي تحتوي على ماكينات phototransduction تتجدد باستمرار في شبكية العين. يتم استبعاد POS أمضى يوميا من قبل خلايا RPE. القوارض، الخنازير / البقري والخلايا RPE الإنسان تعترف POS من مختلف الأنواع بطريقة مماثلة. لتسهيل أداء سلسلة كبيرة من التجارب مع تقلب قليلا، ومخزون كبير من نقاط البيع يمكن عزلها عن عيون الخنزير وتخزينها المجمدة في مأخوذة. هذا البروتوكول يستفيد من خاصية photopigments يتم عرضها على اللون البرتقالي عندما أبقى في الظلام. تحت ضوء أحمر خافت، يتم جمع الشبكية في منطقة عازلة من eyecups افتتح في قطع نصفين. والمتجانس تعليق خلية شبكية العين وتصفيتها وتحميلها على التدرج السكروز المستمر. بعد CENtrifugation، POS تقع في نطاق منفصلة في الجزء العلوي من التدرج الذي يحتوي على لون برتقالي مميز. ثم يتم جمع نقاط البيع، نسج، معلق بالتتابع في مخازن غسل، وعدها aliquoted. POS التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحوصات البلعمة وتحليل تفعيل البروتين، وتوطين أو التفاعل في أوقات مختلفة بعد التحدي POS. بدلا من ذلك، POS يمكن المسمى مع fluorophores، والبريد. ز.، FITC، قبل aliquoting لالكمي مضان لاحق من POS ملزمة أو الغمر. وتشمل التطبيقات الممكنة الأخرى استخدام تعديل POS أو POS التحدي جنبا إلى جنب مع ظروف الإجهاد لدراسة تأثير الإجهاد التأكسدي أو الشيخوخة على خلايا RPE.
Introduction
في شبكية العين، يتم تشغيل الرؤية من خلال المماكبة من الجزيئات حساس يسمى opsins، قبل أن يتم تحويلها إلى إشارة التي يمكن أن تنتقل بين الخلايا العصبية تصل إلى المناطق البصرية في المخ. هي جزء لا يتجزأ هذه الجزيئات في أكوام من الأقراص غشائي تشبه الفطائر التي تشكل أجزاء الجزء الخارجي من خلايا مستقبلة للضوء (PRS). التعرض للالتعرض المستمر للضوء وبالتالي مستويات كبيرة من الإجهاد التأكسدي، المستفيدين الرئيسيين تجديد مستمر فئتها الخارجية للحد من الضرر التأكسدي المحتملين. مبصرة شرائح الخارجي هي على اتصال وثيق مع زغيبات قمية من شبكية العين الصباغ الظهارية (RPE) الخلايا المجاورة. تشكل الخلايا RPE الجزء الخارجي من الجدار الدم في شبكية العين وتضمن العديد من المهام التي تعتبر حاسمة بالنسبة لصحة خلايا مستقبلة للضوء وظيفة 1، مثل التبريد أشعة الضوء عبر أصباغ الميلانين، وإعادة المماكبة للphotoreactive الشبكية المكون أوبسين، وتوفير المواد الغذائية وزrowth العوامل، والمشاركة في التخلص PR الأيض.
وبالإضافة إلى ذلك، والقضاء على الخلايا RPE قضى POS وإعادة تدوير مكوناتها، وهو الاحتلال اليومي الذي ينظمه إيقاع الساعة البيولوجية في شبكية العين الثدييات 2،3. تخليص سقيفة POS ضروري جدا من أجل البقاء PR. عندما يتم إلغاؤها تماما، POS الحطام تتراكم وتتحول المستفيدين الرئيسيين مما تسبب السريع فقدان الرؤية 4،5. في حالة فقدان الملف الشخصى الإيقاعي ويحل محله النشاط المستمر، والعيوب العلاقات العامة وRPE تتراكم مع تقدم العمر 6. ولذلك، فمن المهم جدا أن تميز التنظيم الجزيئي للRPE البلعمة في المختبر من أجل فهم الظواهر مرتبطة الخلل فيها. ومن المثير للاهتمام، والآلات الجزيئية في الخلايا RPE هي مشابهة جدا لتلك المستخدمة من قبل الضامة لمسح الخلايا أفكارك وكلاهما يعتمد على الاعتراف فسفاتيديل تعرض على الحطام أكلة 7-9. لا يزال، والخلايا RPE والضامة تنظم درجة الحموضةagocytosis بشكل مختلف، كما الضامة يختار القضاء الفوري على الخلايا أفكارك في وقت اللقاء في حين أن الخلايا RPE تبتلع بشكل متوازن POS مرة واحدة فقط في اليوم على الرغم من الاتصال بهم الدائم مع شرائح الخارجي. وهذا يشير إلى آليات التنظيم المحددة التي لا تزال غير مفهومة تماما.
وقد تم تحديد العديد من الجزيئات المتورطين في الآلات RPE أكلة أو التحقق من صحتها وذلك بفضل استخدام POS معزولة وثقافة الخلية المقايسات البلعمة. مستقبلات alphavbeta5 إنتغرين تقع في RPE سطح الخلية القمية، وذلك بالتنسيق مع يجند لها مبدعين-E8، يربط خصيصا لPOS 10-12، والتي يتم المنضوية عبر MerTK التيروزين كيناز مستقبلات 13-15. وقد تبين أن زبال مستقبلات CD36 للمشاركة في تناول POS والتأثير سرعته 16،17، ويمكن أن تكون بمثابة جهاز استشعار من الدهون الفوسفاتية أكسدة على السطح POS 18. تدخيل يحتاج تجنيد F-أكتين الهيكل الخلوي الحمارالبروتينات ociated مثل annexin 2 19، الميوسين II 20 وميوسين السابع-أ 21،22. وتستخدم POS الأصلي أو تتأكسد في المختبر أيضا لفهم الظواهر شيخوخة الخلايا RPE في الجسم الحي مرتبطة تراكم سيئة هضمها POS أكسدة 23-28. وقد بدأ جيل من الخلايا RPE المستمدة من الخلايا الجذعية تطبيق جديد لPOS معزولة التي تستخدم لإثبات ظائف الخلايا قبل أن تنقل إلى الحيوانات أو المرضى 29،30،27.
وصف لأول مرة من قبل Molday وزملاؤه في عام 1987 31، وبروتوكول لعزل POS البقري يجمع خطوة تنبيذ فائق من الخليط الشبكية على التدرجات السكروز مستمرة مع ملاحظة ظهور اللون البرتقالي المميز للصباغ متبدل بالضوء في الشبكية غير مقصور (تحمل 11- الشبكية CIS). في السنوات ال 10 الماضية، وذلك بسبب الاحتياطات المتخذة من أجل تقليل خطر مرض جنون البقر، أصبح استخدام عيون الخنزير increasiأبرز ngly. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية الحصول على كميات كبيرة من POS من الخنازير أو عيون البقر التي يمكن aliquoted وتخزينها لفترات طويلة من الزمن. هذا يلغي الحاجة إلى إعداد POS من أعين القوارض، الأمر الذي يتطلب استخدام عدد كبير من الحيوانات في إعداد POS وفحص 32،33،21،22. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إعطاء تفاصيل عن وضع العلامات POS قبل التخزين باستخدام جزيئات الفلورسنت، لتحديد وتصور POS بطريقة مبسطة وقابلة للمقارنة لبعض التطبيقات مقارنة مع وضع العلامات POS بعد الفحص البلعمة 32،10. لذلك، هذه مخزونات كبيرة تسمح للاستنساخ وسهولة الاستخدام في العديد من أنواع مختلفة من التجارب.
Protocol
Representative Results
Discussion
ثلاث خطوات أو شروط حاسمة لتنقية الأمثل: نوعية الصب التدرج وحساسة أنابيب التدرج التلاعب، وحفظ الأنسجة المبردة وفي الظلام حتى الخطوة جمع وقوة اهتزاز الخليط الشبكية للحصول على العزلة POS المناسبة من بقية PR الخلية. إذا ظهرت بعض القضايا في رؤية الفرقة البرتقال بشكل صحيح، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية للبحوث (ناطقون Chercheuses / ناطقون Chercheurs إلى EFN)، مؤسسة VOIR آخرون التورية ومؤسسة بيتنكور Schueller (المنح يونغ محقق لEFN)، المركز الوطني للبحث العلمي (CNRS، موقف دائم للEFN) ، ومعهد العين الوطني من المعاهد الوطنية للصحة (R01-EY13295 إلى SCF). بالإضافة إلى ذلك، يتم تمويل معهد دي لا الرؤية من قبل المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال، جامعة بيير وماري كوري-باريس 6، المركز الوطني للبحث العلمي وزارة باريس.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2-chamber gradient maker | gradient maker with 30-ml chambers | ||
| 3-mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| small size magnetic stir bar | stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| red safelight lamp | inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25×89 cm tubes | Beckman | 344058 | ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30-mL centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| dark ice buckets with lids | |||
| scales | |||
| magnetic stirrer and upholding pole | |||
| refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| labcoat | Health and safety | ||
| gloves | |||
| sleeve protectors | |||
| googles | |||
| absorbent pads | |||
| biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades) | Dissection | ||
| 15-cm plastic dish | |||
| sterile gauze sheets | |||
| 15- and 50-mL tubes | Common consumables | ||
| microtubes | |||
| aluminum foil | |||
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
