Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

In der Netzhaut ist das Sehvermögen durch Isomerisierung von lichtempfindlichen Moleküle, so genannte Opsine, bevor es in ein Signal, das zwischen den Nervenzellen bis zu den bildenden Bereiche im Gehirn übertragen werden können, verwandelt ausgelöst. Diese Moleküle werden in Stapeln von membranöse Scheiben ähnlich Pfannkuchen, die die äußeren Segmentieren von Teilen der Photorezeptorzellen (PRs) bilden eingebettet. An ständige Exposition gegenüber Licht und damit erhebliche Mengen an oxidativen Stress ausgesetzt, PRs kontinuierlich erneuern ihre äußeren Segmente auf mögliche oxidative Schäden zu begrenzen. Photorezeptoraußensegmente sind in engem Kontakt mit apikalen Mikrovilli der benachbarten retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen. RPE-Zellen bilden den äußeren Teil der Blut-Retina-Schranke und gewährleisten eine Vielzahl von Aufgaben, die entscheidend für Photorezeptoren Gesundheit und Funktion ¹ sind, wie beispielsweise Abschrecken Lichtstrahlen über die Melaninpigmente Rückisomerisierung der photoreaktiven Komponente Opsin Retinal, Bereitstellung von Nährstoffen und gACHSTUM Faktoren, die Teilnahme an PR-Metaboliten zur Verfügung.

Außerdem RPE-Zellen eliminieren verbrachte POS und recyceln ihre Komponenten, eine tägliche Beschäftigung, die durch die zirkadianen Rhythmus in Säugernetzhaut ^2,3 geregelt ist. Die Clearance von Schuppen POS ist für PR Überleben absolut notwendig. Wenn es vollständig außer Kraft gesetzt wird, POS Schmutz ansammeln und PRs degenerieren raschem Sehverlust ^4,5. Wenn die rhythmische Profil verloren geht und durch eine konstante Aktivität ersetzt, PR und RPE-Defekte zu akkumulieren mit ⁶ Jahren. Daher ist es sehr wichtig, die molekularen Regulierung der RPE Phagozytose in vitro um Phänotypen seiner Dysfunktion verknüpft verstehen charakterisieren. Interessanterweise ist die molekulare Maschinerie in RPE-Zellen sehr ähnlich dem von Makrophagen verwendet, um apoptotische Zellen zu löschen, und beide sind von der Anerkennung der exponierten Phosphatidylserin auf phagozytischen Trümmer ^7-9. Dennoch RPE-Zellen und Makrophagen regulieren phagocytosis verschieden Makrophagen sich für sofortige Beseitigung apoptotischer Zellen bei Begegnung Zeit während RPE Zellen rhythmisch verschlingen POS nur einmal am Tag trotz dauerndem Kontakt mit äußeren Segmenten. Dies legt nahe, spezifischen Regulationsmechanismen, die noch nicht vollständig verstanden sind.

Viele der Moleküle in der RPE phagozytischen Maschinen gebracht wurden identifiziert oder bestätigt durch die Verwendung von isolierten POS und Zellkulturassays Phagozytose. Die alphavbeta5 Integrin-Rezeptor an der RPE apikalen Zelloberfläche lokalisiert, in Abstimmung mit seinem Liganden MFG-E8, bindet spezifisch an ^POS-10-12, die dann über die MerTK Tyrosinkinase-Rezeptor ^13-15 internalisiert. Die CD36-Scavenger-Rezeptor wurde gezeigt, dass im POS Aufnahme teilnehmen und sie beeinflussen die Geschwindigkeit ^16,17 und könnte als Sensor von oxidierten Phospholipiden am POS Fläche ¹⁸ dienen. Internalisierung muss die Einstellung von F-Aktin-Zytoskelett-associated Proteine ​​wie Annexin 2 ^19, Myosin II ²⁰ und Myosin VIIA ^21,22. Einheimische oder oxidierte POS in vitro auch genutzt werden, um Alterungs Phänotypen der RPE-Zellen in vivo, um die Ansammlung von schlecht verdauten oxidiert POS ^23-28 verbunden zu verstehen. Die Erzeugung von RPE-Zellen aus Stammzellen hat eine neue Anwendung für isolierte POS, die verwendet werden, um die Funktionalität der Zellen nachweisen, bevor sie an Tieren oder Patienten transplantiert ^29,30,27 eingeleitet.

Zuerst von Molday und Kollegen im Jahr 1987 ³¹ beschrieben, das Protokoll für die Isolierung von Rinder POS kombiniert eine Ultrazentrifugationsschritt retinaler Homogenate auf kontinuierliche Saccharosegradienten mit Beobachtung der charakteristische orange Aussehen ungebleichtem retinalen Photopigment (Buch 11-cis Retinal). In den letzten 10 Jahren, aufgrund Vorsichtsmaßnahmen, um das Risiko von Rinderwahnsinn zu minimieren, die Verwendung von Schweineaugen geworden increasingly prominent. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie man große Mengen von POS vom Schwein oder Rind Augen, aliquotiert und für längere Zeiträume gelagert werden können, zu erhalten. Dies beseitigt die Notwendigkeit, POS Nagetier Augen, die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren pro POS Aufbereitung und Analyse ^32,33,21,22 erfordert vorzubereiten. Zusätzlich werden Informationen über POS Kennzeichnung vor der Lagerung unter Verwendung von fluoreszierenden Molekülen gegeben, zu quantifizieren und zu visualisieren POS in einer vereinfachten und vergleichbarer Weise für einige Anwendungen im Vergleich zur Kennzeichnung POS nach dem Phagozytosetest ^32,10. Daher sind diese große Bestände ermöglichen Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit in vielen verschiedenen Arten von Experimenten.