İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Steril insan AB serumu hazırlanması 1. Taze donmuş plazma (TDP) 4-5 çanta toplayın. -20 ° C'de saklayın torbaları yeterince çanta toplanıncaya kadar. Çanta çözülme ve tamamlayıcıyı inaktive ve fibrin çıkarmak için bir su banyosu içinde 56 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. İyice torbaların dış dezenfekte ve 50 ml'lik tüplere için plazma aktarın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüje çökeltilerin ve artık trombositlerin kurtulmak için. Tüm Süpernatantlar havuzu ve pelet atın. Serum kısım 15 ml tüpler içinde, örnekler ve mağaza -20 ° C'de ilave edildi. Not: Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen ısı ile inaktive edilmiş normal insan AB serumu kullanılabilir. Monositler 2. izolasyonu Santrifüj dengelenmesini sağlamak için, iki paralel ince beyaz kat işleme sokulması tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte, ca almakhücrelerin karışımı her donör için farklı malzemeler kullanmak olup yeniden. Durumda, ince beyaz kat kolayca elde edilemez, heparinize edilmiş periferal kan 400 mi yerine kullanılabilir. Dikkatle buffy kat içeren plastik torba dezenfekte ve iki 50 ml'lik tüplere her buffy coat içeriğini aktarmak. Her buffy coat boyunca 15 ml Ficoll çözeltisi (1.077 g / ml) ile üç adet 50 ml tüpler doldurun. Ficoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır. Katman ilk yoğunluk gradyanı için Ficoll çözeltisinin üzerinde çok ince beyaz tabaka kan 30-35 mi. Her iki katmanları karıştırma önlemek için yavaş ve dikkatli bunu yapmak için dikkatli olun. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 400 x g'de santrifüjleyin. Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), beyaz halka toplar. Toplam 40 ml'ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun. Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatant aspire ve 40 ml PBS-EDTA (1 mM) ile, tekrar pelet yıkayın. Her bir vericinin bir havuz için, fenol kırmızı +% 10 FCS olmaksızın, 20 ml RPMI-1640 içinde peletler. İkinci yoğunluk gradyanı için izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi hazırlayın: iki donör 23.13 mi Percoll çözeltisi karışımı için (yoğunluk: 1.131 g / ml), 50 ml bir tüp içinde 10 ml ile 1.87-kat PBS ile yıkandı. Sonra yeni bir 50 ml'lik tüpe Bu çözeltinin 23 ml sevk ve% 46 izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi elde etmek üzere fenol kırmızı +% 10 FCS ile 27 mi RPMI-1640 ekleyin. Percoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır. 50 ml'lik bir tüpe hazırlanan Percoll çözeltisi her defasında 25 mi verici transferi için ve Percoll çözeltisi üzerine 2.9 hazırlanan çözelti PBMC) tabakası. Çok yavaş bir bunu yapmak için dikkatli olund dikkatle, her iki tabaka kolayca karıştırmak için eğilimindedir. Eğer doğru yapılırsa iki faz nedeniyle renk onların farkı ayırt edilebilir. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 550 x g'de santrifüjleyin. Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan monositlerin beyaz halka toplar. Toplam 50 ml'ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun. Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj. Süpernatan aspire ve fenol kırmızı +% 10 FCS, 20 ml RPMI-1640 içinde tekrar süspansiyon pelet. Makrofajlar monositlerin 3. Farklılaşma Tripan mavisi 1:10 seyreltme izole monosit sayısını belirler. Sadece monositlerdir büyük, genellikle düzensiz şekilli hücreler, saymak. Lebfositleridir küçük, yuvarlak şekilli hücreler sayılmaz. NOT: Monosit sayılar sadece hücrelerin farklılaşması için kullanılacak kaç FEP Teflon kaplı olan (küçük veya büyük) çantalar hakkında bir ipucu verir, çünkü çok doğru bir tespit gerekmez. Bir donörden 1,0-1,5 8 x 10 monositler için, büyük bir FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba malzeme için 174 ml RPMI 1640 (Bölüm 1'deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (180 mL toplam hacim) 'den oluşan bir kültür ortamı hazırlar. Bir donörden 3.0-5.0 x 10 7 monositler için, küçük bir Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba için kültür ortamı, 28.5 mi RPMI-1640 (Bölüm 1'deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (30 ml toplam hacim) 'den oluşan hazırlar. NOT: örneğin, 8.0 x 10 7 monositler elde edilirse, biz tw onları tohum tavsiye4.0 x 10 7 hücreleri her biri O küçük hacimli torba. Bunun yerine M-CSF, monositler alternatif olarak aynı konsantrasyonda (2.5 ng / ml), granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile ayırt edilebilir. Hazırlanmış ortamın hücre süspansiyonu (20 mi) ilave edin ve iyice karıştırın. Iki torba tek bir donörden alınmış ise, hücre süspansiyonu, 20 ml RPMI-1640 ekleyin ve daha sonra her bir orta hazırlanması süspansiyonun yansının eklenmesi. İsteğe bağlı: monosit preparasyonu, steril kalırsa, belirlemek için, kan agar plakası üzerine, hücre süspansiyonunun bir damla gözyaşı ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe etmek. FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbanın tıpası üzerine şırınga Perfüzör 50 ml kılıfı Sıkma ve hazırlanan hücre süspansiyonu ile doldurun. Şırınga çıkarın ve çanta dışarı kalan havayı itin. Bir kapanış koni ile çanta kapatın. 37 ° C'de 6-7 gün boyunca çanta inkübe76,% 5 CO2 ile soğutuldu. 4. Makrofaj Hasat Hücrelerin ayrılmasına (en fazla 3 saat mümkün bir enkübasyon) sağlamak için en az 1 saat boyunca buz üzerinde farklı makrofajları ile FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba yerleştirin. Torbanın bütün yüzeyi buzla kaplı olduğundan emin olun. Bir masa / kurulu kenarına minimal basınç 10x ile çanta çekin. Dikkatlice torbanın dışında dezenfekte ve kapanış koni çıkarın. Torbanın tıpa üzerindeki bir 50 ml şırınga Sıkma, hücre süspansiyonu çıkarın ve 50 ml'lik tüplere aktarın. Hücreleri yavaşlamalarını, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve toplam 10 ml RPMI-1640 +% 10 FCS içinde bir torba elde edilen taneler bir araya getirirler. Bir hemositometrede hücre sayısını belirlemek (1: 4-1: tripan mavisi 10 seyreltme). Sadece büyük yuvarlak hücreleri saymak. Not: FEP teflonlanmış torbalarda makrofajları ayırt edilmesinden sonra, artık hücreler verici ve monosit izolasyon kalitesine bağlı olarak, lemfositler, örneğin olabilir. FEP Teflon kaplı bir çanta tekrar kullanmak için, kalan hücrelerin çıkarılması için% 70 etanol ile iki kere yıkayın. 50 mL% 70 etanol ile doldurun ve bir gece boyunca inkübe edilir. Çanta, steril PBS ile 3 kez sterilizasyon kağıdı sarılmasıdır, ve standart prosedürler kullanılarak bir otoklav içinde sterilize yıkayın. NOT: Hücre kültürü çanta makrofaj verimlerinde herhangi bir kayıp olmadan birkaç kez tekrar edilebilir. Ancak, biz onlar sızıntı başlamadan önce 10 kullandıktan sonra çanta atmak için karar verdi. RPMI-1640 +% 10 FCS ve sonraki deneyler için kültür makrofajlar. Daha düşük serum konsantrasyonları gerekli olması halinde,% 1 FCS ile RPMI-1640 içinde kültür da mümkündür. Tohum ve 3-4 saat inkübe hücreleri. Bu dönemden sonra, hücre kültürü makrofajlar çanağının yüzeyine bağlamak dikkatHerhangi bir bulaşık hücreleri (örneğin eritrosit, lenfositler ve dendritik hücreler) süspansiyonu kalır. Yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile en az iki kez hücreleri yıkayın. Daha fazla deneyler için hücre kültürü çanak kültüre makrofajlar ayırmak için, yüzeyi dikkatlice onları kazıyın. Alternatif olarak, buz üzerinde 20 dakika süre ile inkübe yemekler kültür ortamı aspire, ve 1 ml enzimsiz hücre ayrışma tamponunu ilave edin. 37 ° C de 5 dakika inkübasyondan sonra, aşağı doğru en az 3 dakika boyunca 4 mL PBS ekleyin ve pipetleme hücreleri ayırmak ve.